Function of the actin nucleator mitoSPIRE1 in mitochondrial dynamics

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-434381
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.43438

Straub, Felix

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Lizenz: Creative Commons Namensnennung-KeineBearbeitung 4.0 International
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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 01 Jul 2020 12:31

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	1 Juli 2020
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Eugen Kerkhoff
Tag der Prüfung:	28 Mai 2020
Institutionen:	Medizin > Lehrstuhl für Neurologie
Projekte:	"Neurobiology of Emotion Dysfunctions" (GRK 2174)
Stichwörter / Keywords:	mitoSPIRE1, SPIRE1C, SPIRE/FMN, SPIRE/MYO5, transport of mitochondria, actin nucleation
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	43438

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Zusammenfassung (Englisch)

Zusammenfassung (Englisch)

Cells of all known living organisms require a constant energy supply in the form of adenosine triphosphate (ATP) for their survival and function. The intracellular transport and diffusion of ATP molecules are rather limited and thus, ATP producing mitochondria are directly transported to their site of action such as synaptic densities to provide all cellular compartments with an adequate amount of ATP. Fast and long-range transport of mitochondria along microtubule tracks via kinesin and dynein motor proteins is well established, whereas only little is known about actin / myosin functions in mitochondrial transport. There is growing evidence that actin filaments and myosin motor proteins play an essential role in the transport of mitochondria. A SPIRE formin actin nucleator complex facilitates actin filament generation. In addition, SPIRE proteins coordinate myosin 5 (MYO5) motor protein activation at vesicle and organelle membranes. Due to alternative splicing of the SPIRE1 gene, mammalian cells generate four SPIRE proteins from two SPIRE genes. The SPIRE1 actin / myosin organizer is targeted by the alternatively spliced exon 13 towards mitochondrial membranes and the corresponding protein is named ‘mitoSPIRE1’. The present thesis quantitatively addressed the expression of all SPIRE splice variants including mitoSPIRE1 in distinct organs, showing that the brain has the majority of SPIRE expression. In a previous study it was shown that SPIRE1 mutant mice lacking the expression of all SPIRE1 proteins, including mitoSPIRE1, have increased fear in both cued and contextual fear conditioning experiments. To dissect the vesicular and mitochondrial SPIRE functions in fear behavior and to analyze the function of the mitoSPIRE1 protein in more detail, we generated a novel knockout model by targeted deletion of the mouse SPIRE1 exon 13 - the mitoSPIRE1 knockout mouse. Fibroblasts of the novel mitoSPIRE1 knockout mouse and the SPIRE1 mutant mouse show increased mitochondrial motility in live cell fluorescence microscopy analysis. Colocalization studies unraveled that mitoSPIRE1 colocalizes with FMN subfamily formins and MYO5 proteins at mitochondria. Subsequent fluorescence-activated mitochondria sorting (FAMS) experiments confirmed that SPIRE proteins contribute to target MYO5 actin motor proteins towards mitochondrial membranes. Furthermore, FAMS and fluorescence microscopy revealed an influence of mitoSPIRE1 on mitochondrial morphology. SPIRE proteins did not influence mitochondrial oxygen consumption rate, which was analyzed by a Seahorse Mito Stress Test assay. The mentioned function of mitoSPIRE1 in the regulation of mitochondrial motility led us to speculate that mitoSPIRE1 might be involved in targeting mitochondria towards synaptic terminals and thereby influencing synaptic transmission and possibly fear behavior.

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

Sämtliche Zellen lebender Organismen benötigen für ihr Überleben und die erfolgreiche Ausführung der zellulären Funktion eine ausreichende Menge an Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP). Die Diffusion und der Transport von einzelnen Molekülen wie ATP, welches hauptsächlich von Mitochondrien synthetisiert wird, ist intrazellulär stark eingeschränkt. Aus diesem Grund werden Mitochondrien über ein Transportsystem an ihren Einsatzort, beispielsweise synaptische Kontakte, bewegt. In der Literatur ist bereits detailliert beschrieben, dass Kinesin- und Dynein-Motoren einen schnellen, weitreichenden und bidirektionalen Mitochondrientransport entlang von Mikrotubuli ermöglichen. Gleichzeitig ist über einen möglichen mitochondrialen Transport entlang von Aktinfilamenten mittels Myosin-Motoren bisher nur wenig bekannt. Dennoch häufen sich die Hinweise, dass Aktinfilamente sowie Myosin-Motoren den mitochondrialen Transport beeinflussen. Die intrazelluläre Aktinfilament-Bildung wird unter anderem durch den SPIRE / Formin Aktinnukleations-Komplex ermöglicht. Zusätzlich koordinieren SPIRE Proteine die Aktivierung von Myosin 5 Motoren an Vesikel- und Organell-Membranen. Durch alternatives Spleißen entstehen in einer Säugetier-Zelle aus zwei SPIRE Genen insgesamt vier SPIRE Proteine. Hierbei wird durch das alternative Spleißen der SPIRE1 mRNA ein Protein synthetisiert, welches das alternative Exon 13 des SPIRE1 Genes enthält. Das zusätzliche Exon 13 lokalisiert das eigentlich vesikuläre SPIRE1 Protein an die mitochondriale Membran, weshalb dieses dementsprechend als „mitoSPIRE1“ bezeichnet wird. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Expression aller SPIRE Spleißvarianten inklusive mitoSPIRE1 in verschiedenen Organen der Maus quantitativ adressiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Gehirn der Hauptexpressionsort für SPIRE ist. In der Literatur wurde bereits ein Maus-Modell beschrieben, welches keinerlei funktionelle Proteine des SPIRE1 Gens exprimiert und ein erhöhtes Angstverhalten in kontextuellen und reiz-induzierten Angstkonditionierungs-Experimenten aufweist. Um die Funktion des vesikulären und mitochondrialen SPIRE auf das Angstverhalten zu analysieren und die generelle mitoSPIRE1 Funktion zu untersuchen wurde in dieser Arbeit mittels Deletion des SPIRE1 Exon 13 ein neues Knock-out Model erstellt - die mitoSPIRE1 Knock-out Maus. In nachfolgenden Fluoreszenz-Mikroskopie-Analysen lebender Zellen zeigen Fibroblasten der neuen mitoSPIRE1 Knock-out Maus und der SPIRE1 mutant Maus, welche keinerlei funktionsfähige Proteine des SPIRE1 Genes besitzt, eine erhöhte mitochondriale Motilität. Außerdem konnte durch eine umfassende Kolokalisations-Studie gezeigt werden, dass das mitochondriale mitoSPIRE1 mit FMN und MYO5 Proteinen an Mitochondrien kolokalisiert. Hierbei wurde durch fluorescence-activated mitochondria sorting (FAMS) Experimente bestätigt, dass unter anderem SPIRE für die Translokation von MYO5 Proteinen auf mitochondriale Membranen benötigt wird. Zusätzlich wurde mittels FAMS und mikroskopischen Analysen gezeigt, dass mitoSPIRE1 die mitochondriale Morphologie beeinflusst. Im Gegensatz dazu haben SPIRE Proteine des SPIRE1 Genes keinen Einfluss auf die oxygen consumption rate der Mitochondrien, was mit einem Seahorse Mito Stress Test Assay festgestellt wurde. Die hier gezeigte Funktion von mitoSPIRE1 in der mitochondrialen Motilität impliziert, dass mitoSPIRE1 die mitochondriale Verankerung an synaptischen Nervenenden und aus diesem Grund die synaptische Transmission und das Angstverhalten beeinflussen könnte.

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