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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-435946
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.43594
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 11 August 2020 |
| Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Katja Dettmer-Wilde |
| Tag der Prüfung: | 3 August 2020 |
| Institutionen: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Mass spectrometry; glutathione determination; tracer analysis |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 43594 |
Zusammenfassung (Englisch)
This thesis describes the development and optimization of mass spectrometry-based methods for glutathione determination and 13C-tracer analysis in cultured cells. Glutathione is an essential endogenous antioxidant and plays an important role in cellular defense against oxidative damage. In this thesis, an HPLC-UV-MS method was developed for the simultaneous determination of GSH and GSSG in ...
Zusammenfassung (Englisch)
This thesis describes the development and optimization of mass spectrometry-based methods for glutathione determination and 13C-tracer analysis in cultured cells. Glutathione is an essential endogenous antioxidant and plays an important role in cellular defense against oxidative damage. In this thesis, an HPLC-UV-MS method was developed for the simultaneous determination of GSH and GSSG in cultured cells following derivatization of GSH with N-ethylmaleimide (NEM) to prevent GSH autooxidation. LC-UV was used to detect the GS-NEM conjugate by monitoring its UV absorbance at 210 nm. Subsequently, GSSG and the corresponding stable isotope labeled internal standard (glutathione-(glycine-13C4,15N2)) were detected by mass spectrometry. Here, direct GSSG determination can be achieved without additional sample preparation. The method implemented in this thesis provides a straightforward and rapid approach for GSH and GSSG determination in cell culture samples and other biospecimens that may require minor adaption of the method. In some cases, only the total glutathione pool is of the interest. To that end, an optimized reduction procedure, employing dithiothreitol (DTT), was developed to achieve quantification of total reduced glutathione (tGSH) in cultured cells by LC-MS. Both of the developed methods introduced above were validated by testing LOD, LLOQ, intra-/inter-day precision, as well as recoveries with spike-in experiments.
In addition to quantitative metabolite analysis, 13C-tracer experiments to study metabolism are a major component of this thesis. In this context, a wide window MRM strategy on a QTOF instrument was introduced to perform 13C-tracer analysis of glutathione. With this approach, isotopologue profiles of both precursor and product ions can be obtained simultaneously with high resolution, thus obviating the need to set up individual transitions. Q1 window width was adjusted to achieve accurate determination and to reduce potential interferences as much as possible. The developed method was applied to U-13C-glucose / U-13C-glutamine tracer analysis of glutathione in wild-type and IDH1-R132H mutant HCT116 cells to study the contributions of glucose and glutamine to glutathione biosynthesis in the absence or presence of IDH1 mutation. Interestingly, IDH1-R132H cells exhibited a higher dependence on glutamine for glutathione biosynthesis than wild-type controls. The strategy introduced here can also be employed to the tracer analysis of other metabolites after a metabolite specific optimization of the MRM window width.
Finally, by combining U-13C-glucose / glutamine tracing experiments with mass spectrometry-based 13C labeling profile analysis, the effects of different IDH1/2 mutations on cellular metabolism were systematically investigated by comparing 13C enrichment and isotopologue distribution in various metabolites including amino acids, organic acids, fatty acids, and GSH in the HCT116 cell panel. Changes in metabolism observed due to IDH1/2 mutation included different pathways and substrates that the cells use to supply TCA cycle intermediates, fatty acids, amino acids, as well as endogenous antioxidant glutathione. Cells harboring an IDH mutation tend to rely more on glutamine to refuel intracellular amino acids such as glutamate and aspartate, GSH, as well as TCA intermediates. In addition, the de novo biosynthesis of fatty acids is significantly decreased in IDH mutant cells.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung und Optimierung massenspektrometriebasierter Methoden zur Glutathionbestimmung und 13C-Tracer-Analyse in kultivierten Zellen. Glutathion ist ein essentielles endogenes Antioxidans und spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Verteidigung gegen oxidative Schäden. In dieser Arbeit wurde eine HPLC-UV-MS-Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von GSH und ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung und Optimierung massenspektrometriebasierter Methoden zur Glutathionbestimmung und 13C-Tracer-Analyse in kultivierten Zellen. Glutathion ist ein essentielles endogenes Antioxidans und spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Verteidigung gegen oxidative Schäden. In dieser Arbeit wurde eine HPLC-UV-MS-Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von GSH und GSSG in kultivierten Zellen nach Derivatisierung von GSH mit N-Ethylmaleimid (NEM) entwickelt, um die GSH-Autooxidation zu verhindern. LC-UV wurde verwendet, um das GS-NEM-Konjugat durch Überwachung seiner UV-Absorption bei 210 nm nachzuweisen. Anschließend wurden GSSG und der entsprechende stabile isotopenmarkierte interne Standard (Glutathion-(Glycin-13C4,15N2)) massenspektrometrisch nachgewiesen. Hier kann eine direkte GSSG-Bestimmung ohne zusätzliche Probenvorbereitung durchgeführt werden. Die in dieser Arbeit implementierte Methode bietet einen einfachen und schnellen Ansatz für die GSH- und GSSG-Bestimmung in Zellkulturproben und anderen Bioproben, die möglicherweise eine geringfügige Anpassung der Methode erfordern. In einigen Fällen ist nur der gesamte Glutathion-Pool von Interesse. Zu diesem Zweck wurde ein optimiertes Reduktionsverfahren unter Verwendung von Dithiothreitol (DTT) entwickelt, um eine Quantifizierung des reduzierten Gesamtglutathions (tGSH) in kultivierten Zellen mittels LC-MS zu erreichen. Die beiden oben vorgestellten entwickelten Methoden wurden durch Testen von LOD, LLOQ, Intra-/Intraday-Präzision sowie Wiederfindungen mit Spike-in-Experimenten validiert.
Neben der quantitativen Metabolitenanalyse sind 13C-Tracer-Experimente zur Untersuchung des Metabolismus ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit. In diesem Zusammenhang wurde eine Wide Window MRM-Strategie auf einem QTOF-Instrument vorgestellt, um eine 13C-Tracer-Analyse von Glutathion durchzuführen. Mit diesem Ansatz können Isotopenprofile sowohl von Vorläufer- als auch von Produkt-Ionen gleichzeitig mit hoher Auflösung erhalten werden, so dass die Notwendigkeit, individuelle Übergänge zu erstellen, entfällt. Die Breite des Q1-Fensters wurde angepasst, um eine genaue Bestimmung zu erreichen und mögliche Interferenzen so weit wie möglich zu reduzieren. Die entwickelte Methode wurde auf die U-13C-Glukose/U-13C-Glutamin-Tracer-Analyse von Glutathion in Wildtyp- und IDH1-R132H-mutierten HCT116-Zellen angewandt, um die Beiträge von Glukose und Glutamin zur Glutathion-Biosynthese bei Fehlen oder Vorhandensein der IDH1-Mutation zu untersuchen. Interessanterweise wiesen IDH1-R132H-Zellen eine höhere Abhängigkeit von Glutamin für die Glutathion-Biosynthese auf als Wildtyp-Kontrollen. Die hier vorgestellte Strategie kann nach einer metabolitenspezifischen Optimierung der MRM-Fensterbreite auch für die Tracer-Analyse anderer Metaboliten eingesetzt werden.
Schließlich wurden durch die Kombination von U-13C-Glukose-/Glutamin-Tracing-Experimenten mit massenspektrometriebasierter 13C-Markierungsprofilanalyse die Auswirkungen verschiedener IDH1/2-Mutationen auf den zellulären Metabolismus systematisch untersucht, indem die 13C-Anreicherung und die Isotopenverteilung in verschiedenen Metaboliten einschließlich Aminosäuren, organischen Säuren, Fettsäuren und GSH im HCT116-Zellpanel verglichen wurden. Die aufgrund der IDH1/2-Mutation beobachteten Veränderungen des Stoffwechsels umfassten verschiedene Wege und Substrate, die die Zellen verwenden, um TCA-Zyklus-Zwischenprodukte, Fettsäuren, Aminosäuren sowie das endogene Antioxidans Glutathion zu liefern. Zellen, die eine IDH-Mutation beherbergen, neigen dazu, sich mehr auf Glutamin zu verlassen, um intrazelluläre Aminosäuren wie Glutamat und Aspartat, GSH sowie TCA-Zwischenprodukte zu tanken. Darüber hinaus ist die De-novo-Biosynthese von Fettsäuren in IDH-Mutantenzellen signifikant vermindert.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 16:15
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