| License: Creative Commons Attribution 4.0 (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-437726
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.43772
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 30 June 2021 |
| Referee: | Prof. Dr Reinhard Sterner and Prof. Dr. Remco Sprangers |
| Date of exam: | 8 September 2020 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | konformationelle Dynamik, Enzymkatalyse, Allosterie conformational dynamics, enzyme catalysis, allostery |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 43772 |
Abstract (English)
Imidazole glycerol phosphate synthase (ImGPS) is a bienzyme complex from histidine biosynthesis, which consists of the cyclase subunit HisF and the glutaminase subunit HisH. In HisH, glutamine is hydrolysed to glutamate and ammonia, which is channelled through an intramolecular tunnel to the HisF active site, where it reacts with N’-[(5’-phosphoribulosyl)-formimino]-5-aminoimidazole-4-carboxamide ...
Abstract (English)
Imidazole glycerol phosphate synthase (ImGPS) is a bienzyme complex from histidine biosynthesis, which consists of the cyclase subunit HisF and the glutaminase subunit HisH. In HisH, glutamine is hydrolysed to glutamate and ammonia, which is channelled through an intramolecular tunnel to the HisF active site, where it reacts with N’-[(5’-phosphoribulosyl)-formimino]-5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (PrFAR) to form imidazole glycerol phosphate (ImGP), a precursor of histidine, and 5-aminoimidazole-4-carboxamide-ribotide (AICAR), which is salvaged in purine biosynthesis. The two reactions are tightly coupled: HisH is strongly activated by the binding of PrFAR to HisF by a V-type allosteric mechanism to limit unproductive glutamine hydrolysis.
HisF adopts a ()8-barrel fold, the most common and versatile single domain fold in nature. Proteins with this fold are of particular interest to study fundamental principles of enzyme catalysis. One of these aspects is the connection between conformational dynamics and catalytic function. In the last few decades, this connection has become a major field of research and many examples have been found in which motions have a central role in the catalytic cycle of the respective enzyme.
The first part of this thesis is dedicated to the connection between catalysis and conformational dynamics, in particular of the 11-loop (loop1) in HisF, which is in close proximity to the active site. This loop has previously been shown to be important for HisF activity and has been observed to adopt two distinct conformations in X-ray crystal structures called the open and closed conformations. Mutational analysis in this work identified several key amino acid residues within loop1 that are essential for catalysis. Specifically, the mutations G20P, G30P and F23A resulted in a complete loss or a drastic reduction of HisF activity. The two glycine residues appear to serve as hinges on which the loop can move to adopt different conformations. F23 probably serves as a hydrophobic anchor, which fixes the loop in the open conformation. NMR paramagnetic enhancement measurements confirmed that the open conformation is the main conformation in solution, for wild type HisF as well as HisF F23A and HisF G20P. Changes in loop dynamics for these two variants were confirmed with limited proteolysis and electron paramagnetic resonance spectroscopy.
To gain a deeper insight into HisF catalysis, transient ligand binding kinetics were recorded. Since the fluorescence of W156 of HisF proved unsuitable as a binding signal, the unnatural amino acid L-(7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycine (CouA) was incorporated at position 132. The resulting variant HisF K132CouA showed wild-type like activity and a strong spectroscopic signal upon binding of all used HisF ligands. Stopped-flow measurements allowed for the determination of binding and dissociation rate for all ligands and a kinetic model for the entire ammonia dependent HisF reaction was formulated. The kinetic analysis also revealed an induced-fit type conformational motion upon PrFAR binding. This motions could not be observed for labelled variants carrying the mutations F23A or G20P, indicating that loop1 plays an integral role in this conformational change.
The second part of this thesis is concerned with the allosteric communication within ImGPS, specifically the stimulation of glutaminase activity in the HisH subunit. It was already previously recognized that conformational dynamics are of central importance for the transmission of the allosteric signal in ImGPS. Here, it could be shown that the flexible HisF loop1 has a strong influence on the activation of HisH. Mutations in loop1 that reduced HisF activity also decreased capability of HisF to stimulate HisH activity. Both effects appear to be coupled to the induced-fit type motion of loop1 after PrFAR binding. Moreover, also other residues outside loop1 were identified that play an important role in ImGPS allostery. Specifically, the crystal structure of the
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mutant V48A, which was observed to reduce HisH stimulation in a previous study, led to the discovery of conformational changes of I7 and L169, two residues within the ammonia channel of HisF. Mutation of either residue led to a reduction in HisH stimulation.
Previously, two hypotheses have been proposed to explain the strong allosteric activation of HisH catalysis on a molecular level: The formation of the oxyanion hole and increased release of ammonia. A factor that has hitherto not been studied is whether the protonation states of catalytic H178 and C84 in HisH change during allosteric activation. Measurement of the pH-dependency of the HisH reaction allowed for the determination of two pKa values which most likely correspond to these two residues. This conclusion was supported by measurements of the inactivation kinetics of HisH with the suicide inhibitor acivicin. NMR measurements with 13C labelled H178 at physiological pH demonstrated that the catalytic histidine is protonated upon allosteric activation, which in turn stabilizes the deprotonated state of the catalytic cysteine. This change only manifested in the presence of glutamine and the PrFAR analogue ProFAR, indicating that both ImGPS substrates are needed for HisH to adopt the active conformation. It was hypothesized that the HisF residue D98, which is located within the interface with HisH, contributes the change of the protonation state of H178. Indeed, the mutation D98E, which mimics the approximation of the D98 carboxyl group to the active site of HisH led to a significant increase in both basal and ProFAR activated HisH activity. The closer proximity of the carboxyl group in the mutant D98E could be confirmed by X-ray crystallography. In a structure with bound glutamine and ProFAR, E98 shows an alternative conformation, which is an indication that it undergoes a conformational change during allosteric activation. While these results show that the tuning of the protonation of the catalytic residues in HisH is part of the activation mechanism, mutational analysis of V51 and the Ω-loop of HisH support the hypothesis that the correct formation of the oxyanion hole also makes a significant contribution to the stimulation of HisH. Thus, it appears that several factors contribute to HisH stimulation, highlighting the complex nature of allostery in this bienzyme complex.
Finally, measurements of the steady-state concentration of thioester intermediate carrying enzyme showed that both half-reactions, the formation and the hydrolysis of the thioester, are strongly accelerated during allosteric activation of HisH. This further supports the notion that allosteric activation influences a chemical factors that are important for both half-reactions.
In conclusion, the results presented in this thesis have revealed important information on the inner workings of the bienzyme complex ImGPS. Conformational dynamics are clearly of paramount importance both for the reaction catalyzed by HisF as well as for the allosteric activation of HisH. Further study of this intriguing system will undoubtedly increase our understanding of enzyme catalysis and enzyme complexes.
Translation of the abstract (German)
Die Imidazolglycerinphosphatsynthase (ImGPS) ist ein Bienzymkomplex aus der Histidinbiosynthese, welcher aus der Cyclaseuntereinheit HisF und der Glutaminaseuntereinheit HisH besteht. In HisH wird Glutamin zu Glutamat und Ammoniak hydrolysiert, der dann durch einen intramolekularen Kanal zum aktiven Zentrum von HisF gelangt und dort mit ...
Translation of the abstract (German)
Die Imidazolglycerinphosphatsynthase (ImGPS) ist ein Bienzymkomplex aus der Histidinbiosynthese, welcher aus der Cyclaseuntereinheit HisF und der Glutaminaseuntereinheit HisH besteht. In HisH wird Glutamin zu Glutamat und Ammoniak hydrolysiert, der dann durch einen intramolekularen Kanal zum aktiven Zentrum von HisF gelangt und dort mit N’-[(5’-phosphoribulosyl)-formimino]-5-aminoimidazol-4-carboxamid-Ribonukleotid (PrFAR) reagiert um Imidazolglycerinphosphat, ein Vorläufermolekül von Histidin, und 5-aminoimidazol-4-carboxamid-Ribotid (AICAR) zu bilden. AICAR wird in der Purin-Biosynthese wiederverwertet. Die beiden Teilreaktionen sind strikt gekoppelt: HisH wird durch die Binding von PrFAR in einem V-Typ allosterischen Mechanismus stark aktiviert um unproduktive Hydrolyse von Glutamin zu vermeiden.
HisF nimmt eine ()8-barrel Faltung an, die am verbreitetsten und vielseitigste einzelne Domänen-Faltung. Proteine mit dieser Faltung sind vom besonderem Interesse in Untersuchungen zu den grundlegenden Prinzipien von Enzymkatalyse. Einer dieser Aspekte ist die Verbindung zwischen konformationellen Bewegungen und der Katalysefunktion von Enzymen. In den letzten Jahrzehnten ist dies ein großes Forschungsgebiert geworden und viele Beispiele wurden gefunden in denen Bewegungen eine zentrale Rolle im katalytischen Zyklus der entsprechenden Enzyme einnehmen.
Der erste Teil dieser Arbeit ist dem Zusammenhang zwischen Katalyse und konformationellen Bewegungen, im Speziellen denen des 11-loop (loop1) in HisF, welcher sich in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrums befindet, gewidmet. Es wurde bereits gezeigt, dass dieser loop von großer Bedeutung für die Aktivität von HisF ist. In Rötgenstrukturen wurde er in zwei verschiedenen Konformationen beobachtet, die die offene und die geschlossen Konformation genannt werden. In dieser Arbeit konnten mehrere Schlüssel-Aminosäuren durch Mutationsanalyse identifiziert werden. Besonders drastisch waren die Mutationen G20P, G30P und F23A, die zu einem kompletten Verlust oder einer drastischen Reduktion der HisF-Aktivität führten. Die zwei Glycin-Reste scheinen eine Art Scharnier zu bilden, das es dem loop erlaubt, unterschiedliche Konformationen einzunehmen. F23 dient vermutlich als hydrophober Anker, der den loop in der offenen Konformation fixiert. Durch paramagnetische Relaxationsverstärkung in NMR-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die offene Konformation die häufigste Konformation in Lösung ist, sowohl für Wildtyp-HisF, als auch HisF F23A und HisF G20P. Änderungen in konformationeller Dynamik wurden für die zwei Varianten in limitierter Proteolyse und Elektronenspinresonanzspektroskopie nachgewiesen werden.
Um tiefere Einblicke in die Katalyse von HisF zu gewinnen wurden transiente Bindungskinetiken verschiedener Liganden aufgenommen. Da sich die intrinsische Tryptophanfluoreszenz als ungeeignete Sonde für Ligandenbindung erwies, wurde die unnatürliche Aminosäure L-(7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycin (CouA) in Position 132 eingebracht. Die resultierende Variante HisF K132CouA zeigte wildtypische Aktivität und ein starkes spektroskopisches Signal bei Bindung aller HisF-Liganden. Stopped-flow Messungen erlaubten die Bestimmung von Bindungs- und Dissoziationsraten für alle Liganden und ein kinetisches Modell für die gesamte Ammoniak-abhängige HisF-Rekation wurde aufgestellt.
Die kinetische Bindungsanalyse konnte auch eine konformationelle Änderung in Form eines induced fit aufdecken. Da diese Bewegung in markierten Varianten mit den Mutationen F23A oder G20P nicht beobachtet werden konnte, liegt es nahe, dass loop1 eine wichtige Rolle in dieser konformationellen Veränderung einnimmt.
Der zweite Teil dieser Arbeit behandelt die allosterische Kommunikation innerhalb der ImGPS, genauer gesagt die Stimulierung der Glutaminase-Aktivität der HisH-Untereinheit. Es wurde schon in früheren Arbeiten gezeigt, dass konformationelle Dynamik von zentraler Bedeutung für
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die Weiterleitung des allosterischen Signals in der ImGPS ist. Hier konnte gezeigt werden, dass der flexible loop1 in HisF einen starken Einfluss auf die Aktivierung von HisH hat. Mutationen, die HisF-Aktivität reduzieren, verringern auch die Fähigkeit von HisF, HisH-Aktivität zu stimulieren. Beide Effekte scheinen mit dem induced fit von loop1 nach PrFAR-Bindung verbunden zu sein. Darüber hinaus konnten auch andere Reste identifiziert werden, die an der Allosterie in der ImGPS beteiligt sind. Konkret führte die Analyse der Kristallstruktur der Mutante V48A, für die eine geringere HisH-Aktivierung in einer früheren Studie beobachtet wurde, zur Entdeckung von konformationellen Veränderungen in den Resten I7 und L169, zwei Resten im Ammonikkanal von HisF. Die Mutation beider Reste führt zu verringerter HisH-Aktivierung.
Zuvor wurden bereits zwei Hypothesen aufgestellt, die die starke Aktivierung von HisH auf der molekularen Ebene erklären: Die Ausbildung des Oxianionenlochs und eine gesteigerte Freisetzung von Ammoniak. Ein Faktor, der bis jetzt noch nicht betrachtet wurde, ist ob die Protonierungszustände der katalytischen Aminosäurereste H178 und C84 sich während der allosterischen Aktivierung ändern. Die Messung der pH-Abhängigkeit der HisH-Reaktion erlaubte die Bestimmung von zwei pKS-Werten, die aller Wahrscheinlichkeit nach diesen zwei Resten zugeordnet werden können. Diese Schlussfolgerung konnte durch Messung der Inaktivierungskinetik mit dem irreversiblen Inhibitor Acivicin gestützt werden. NMR-Messungen mit 13C-markiertem H178 bei physiologischem pH zeigten, dass allosterische Aktivierung zur Erhöhung der Protonierung des katalytischen Histidins führt, was wiederum den deprotonierten Zustand des katalytischen Cysteins stabilisiert. Diese Änderung manifestiert sich nur in der Anwesenheit von sowohl Glutamin als auch dem PrFAR-Analog ProFAR, was ein starker Hinweise darauf ist, dass beide ImGPS Substrate benötigt werden, damit HisH die aktive Konformation ausbilden kann. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass der HisF-Rest D98, welcher sich in der Kontaktfläche mit HisH befindet, zur Änderung der Protonierung von H178 beiträgt. In der Tat konnte für die Mutante D98E, welche eine Annäherung der Carboxylgruppe von D98 an das aktive Zentrum von HisH nachahmt, eine signifikante Erhöhung der basalen als auch der durch ProFAR aktivierten HisH-Aktivität nachgewiesen werden. Die Annäherung der Carboxylgruppe konnte durch Röntgenkristallographie nachgewiesen werden. In einer Struktur mit gebundenem Glutamin und ProFAR zeigt E98 eine alternative Konformation, was zeigt, dass dieser Rest seine Konformation während der allosterischen Aktivierung verändert. Während diese Ergebnisse zeigen, dass die Protonierung der katalytischen Reste in HisH eine wichtige Rolle des Aktivierungsmechanismus sind, stützen Mutationsanalysen des Restes V51 sowie des Ω-loops die Hypothese, dass die korrekte Bildung des Oxianionenlochs einen signifikanten Beitrag zur Stimulierung von HisH leistet. Es scheint daher, dass mehrere Faktoren an der HisH-Stimulierung beteiligt sind, was die komplexe Natur der Allosterie in diesem Bienzymkomplex noch einmal unterstreicht.
Abschließend konnten Messungen der Konzentration an Enzym, welches das Thioester-Intermediat während des steady-state trägt, zeigen, dass beide Halb-Reaktionen von HisH, die Bildung des Thioesters und seine Hydrolyse, während der allosterischen Aktivierung stark beschleunigt werden. Dies unterstützt weiter die Annahme, allosterische Aktivierung Einfluss auf einen chemischen Faktor nimmt, der beide Halb-Reaktionen beeinflusst.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in dieser Arbeit wichtige Informationen zur inneren Funktionsweise des Bienzymkomplexes ImGPS aufgedeckt wurden. Konformationelle Bewegungen sind offensichtlich von außerordentlicher Bedeutung, sowohl für die von HisF katalysierte Reaktion als auch für die allosterische Aktivierung von HisH. Weitere Studien dieses faszinierenden Systems werden mit Sicherheit unser Verständnis von Enzymkatalyse und Enzymkomplexen weiter verbessern.
Metadata last modified: 30 Jun 2021 06:10
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