| License: Publishing license for publications excluding print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-438054
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.43805
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Date: | 18 October 2021 | ||||||
| Referee: | Prof. Dr. Günther Bernhardt | ||||||
| Date of exam: | 9 September 2020 | ||||||
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) | ||||||
| Projects: | GRK 1910, Graduiertenkolleg "Medicinal Chemistry of Selective GPCR Ligands" | ||||||
| Identification Number: |
| ||||||
| Keywords: | GPCR, Histamine H3 Receptor, Histamine H4 Receptor Orthologs, Molecular Tools, Radioligands, Fluorescent ligands, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) | ||||||
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 615 Pharmacy | ||||||
| Status: | Published | ||||||
| Refereed: | Yes, this version has been refereed | ||||||
| Created at the University of Regensburg: | Yes | ||||||
| Item ID: | 43805 |
Abstract (English)
Over the years, the histamine H3 and H4 receptors have emerged as promising therapeutic targets. By contrast to the H3R, the number of drug candidates for the H4R is very limited. Possible reasons are the not fully elucidated expression pattern of the H4R and the marked species [human (h), mouse (m), rat (r)]-dependent differences, regarding affinities, potencies and/or the quality of action of ...
Abstract (English)
Over the years, the histamine H3 and H4 receptors have emerged as promising therapeutic targets. By contrast to the H3R, the number of drug candidates for the H4R is very limited. Possible reasons are the not fully elucidated expression pattern of the H4R and the marked species [human (h), mouse (m), rat (r)]-dependent differences, regarding affinities, potencies and/or the quality of action of several H4R ligands. Consequently, the translational value of rodent models is compromised.
Radio- and fluorescent ligands with a balanced affinity-/functional profile at the H4R species orthologs can be valuable molecular tools to gain a deeper understanding of the H4R via rodent models. However, a radioligand, eligible for robust binding studies at the h/m/rH4Rs, is not described so far. Likewise, a high affinity fluorescent ligand, which would allow imaging studies (e.g. by confocal microscopy) of the hH4R and bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based binding studies at the H4R species orthologs is missing. For the hH3R, only two purchasable fluorescent probes were applied in BRET-based assays, but both are poorly characterized and show less than ideal spectral properties.
Therefore, this thesis aimed at the development of two complementary molecular tools: on one hand, a high affinity radioligand that can be used for comparative binding studies at the h/m/rH4Rs. On the other hand, a comprehensively characterized fluorescent ligand, enabling localization studies of the hH4Rs in live cells and comparative BRET-based binding studies at the NLuc-tagged h/mH4Rs and hH3R.
To achieve the first goal, a library of 2,4-diaminopyrimidines, based on the structure of the equipotent h/m/rH4Rs agonist (R)-4-(3-aminopyrrolidin-1-yl)-N-neopentylpyrimidin-2-amine (3.33), was prepared. The parent compound was modified in position 4 by introducing (cyclic) aliphatic amines (partly methylated, propionylated or guanidinylated) and histamine (homologs). After characterizing the prepared compounds in radioligand competition binding assays, the 2,4-diaminopyrimidines with pKi values > 7.0 at the hH4R were investigated in functional assays at the h/m/rH4Rs to guide the selection of target structures for radiolabeling. UR-DEBa148 (3.43) was found to exhibit sub-nM potencies at the h/m/rH4Rs and was slightly G protein biased. On the other hand, the (partial) agonist UR-DEBa176 (3.46), with comparable potencies at the h/m/rH4Rs [pEC50 (luciferase reporter gene assays): 8.7, 9.0, 9.2, respectively], was found to constitute the “cold” form of a potential radioligand. Using [3H]methyl nosylate, [3H]3.46 was obtained (radiochemical purity: 99%; specific activity: 43.1 Ci/mmol), revealing a high chemical stability over a storage period of 11 months (EtOH/H2O 70/30; −20 °C). In radioligand binding assays at the h/m/rH4Rs, [3H]3.46 proved to be a useful molecular tool for comparative robust studies [pKd (sat): 7.4, 7.8, 7.7, respectively; low nonspecific binding (11−17%, ∼Kd); comparably fast kinetics (25−30 min)].
To meet the second aim, a set of histamine (homologs) were labeled with the pyrylium-5 (Py 5) fluorophore. Py-5 (4.10) was chosen as fluorophore, as it is well suited for NLuc-based BRET assays due to its spectral properties, its small size and the convenient synthesis. Radioligand competition binding studies revealed high affinities in the sub- to the two-digit-nM range at the hH3,4Rs, especially for the imbutamine UR-DEBa242 (4.26) and the impentamine 4.27. Fluorescent probe 4.26 was found to be the most notable compound in this series: in functional assays, potencies or antagonistic activities in the one- to the two-digit-nM range were obtained at the hH3R (partial agonist), the hH4R (inverse agonist) and the mH4R (inverse agonist/antagonist). Since among the synthesized compounds 4.26 revealed the highest affinity at the hH4R, confocal microscopy was performed and proved it a suitable probe for staining the hH4R in live cells. Comprising ideal optical properties as a BRET acceptor for NLuc, 4.26 enables robust and comparative BRET-based binding studies at the NLuc-hH3R and NLuc-h/mH4Rs [pKd (sat): 8.8, 7.8, 7.2, respectively; comparably fast kinetics (≈2 min)].
As the first described high affinity radio- and fluorescent ligands enabling comparative binding studies at the H4R species orthologs, [3H]3.46 and 4.26 can support pharmacological investigations on the H4R with respect to rodent models (e.g. early stage characterization of novel molecular tools or potential drug candidates in radioligand- or BRET-based binding assays). Moreover, 4.26 can contribute to investigations on the expression of the H4R by enabling hH4R localization in live cells. Finally, as being easy-to-synthesize, comprehensively characterized and ideally suited for NLuc-based BRET, 4.26 represents a superior alternative to the purchasable fluorescent ligands, which were previously used in BRET-based binding assays at the NLuc-hH3,4Rs.
Translation of the abstract (German)
Radio- und Fluoreszenzliganden mit einem speziesübergreifend ausgewogenen Affinitäts-/ Funktionalitätsprofil an den Histamin H4 Rezeptor (H4R) Orthologen [Mensch (h), Maus (m), Ratte (r)] stellen wertvolle molekulare Werkzeuge dar, um mit Hilfe von Nagermodellen ein tieferes Verständnis für den H4R zu erhalten. Allerdings ist bisher kein Radioligand beschrieben, der sich für robuste ...
Translation of the abstract (German)
Radio- und Fluoreszenzliganden mit einem speziesübergreifend ausgewogenen Affinitäts-/ Funktionalitätsprofil an den Histamin H4 Rezeptor (H4R) Orthologen [Mensch (h), Maus (m), Ratte (r)] stellen wertvolle molekulare Werkzeuge dar, um mit Hilfe von Nagermodellen ein tieferes Verständnis für den H4R zu erhalten. Allerdings ist bisher kein Radioligand beschrieben, der sich für robuste Bindungsstudien an den h/m/rH4 Rezeptoren eignet. Ebenso fehlt ein hochaffiner Fluoreszenzligand, der bildgebende Studien (z.B. mittels Konfokalmikroskopie) am hH4R, aber auch Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)-basierte Bindungsstudien an den H4R Orthologen ermöglicht. Für den hH3R wurden bereits kommerziell erhältliche Fluoreszenzliganden in BRET-basierten Bindungsassays eingesetzt, die aber aufgrund ihrer mangelhaften Charakterisierung und ihrer nicht optimalen spektralen Eigenschaften wenig geeignet erscheinen.
Deshalb zielte diese Arbeit auf die Entwicklung von zwei komplementären molekularen Werkzeugen ab: Einerseits auf einen hochaffinen Radioliganden, der für vergleichende Bindungsstudien an den h/m/rH4 Rezeptoren verwendet werden kann. Zum anderen auf einen umfassend charakterisierten Fluoreszenzliganden, der Lokalisationsstudien am hH4R in lebenden Zellen und vergleichende BRET-basierte Bindungsstudien an den NLuc-markierten h/mH4 und hH3 Rezeptoren ermöglicht.
Für die Entwicklung des Radioliganden wurde ausgehend von dem literaturbekannten und äquipotenten h/m/rH4R Agonisten (R)-4-(3-Aminopyrrolidin-1-yl)-N-neopentylpyrimidin-2-amin eine Substanzbibliothek entwickelt. Dazu wurden (cyclische) aliphatische Amine (teilweise methyliert, propionyliert oder guanidinyliert) und Histamin (-homologe) in Position 4 eingeführt. Diese wurden in Kompetitionsbindungsassays aber auch in funktionellen Assays untersucht, um eine Auswahl von Zielstrukturen für die Radiomarkierung zu treffen. UR-DEBa148 (3.43) zeigte sich an den h/m/rH4 Rezeptoren als hochpotenter Agonist mit EC50-Werten im subnanomolaren Bereich und mit einem leichten Bias zum G-Protein Signalweg. Daneben überzeugte der (Partial-) Agonist UR-DEBa176 (3.46) mit vergleichbaren Potenzen an den h/m/rH4 Rezeptoren [pEC50 (Luciferase Reportergen Assays): 8,7, 9,0 bzw. 9,2] als "kalte" Form eines potenziellen Radioliganden. Unter Verwendung von [3H]Methylnosylat wurde [3H]3.46 erhalten (radiochemische Reinheit: 99%; spezifische Aktivität: 43,1 Ci/mmol). In Radioligandbindungsassays an den h/m/rH4 Rezeptoren erwies sich [3H]3.46 als nützliches molekulares Werkzeug für speziesübergreifende robuste Bindungsstudien [pKd (sat.): 7,4, 7,8 bzw. 7,7; unspezifische Bindung (11-17%, ∼Kd); vergleichsweise schnelle Kinetik (25-30 Min.)].
Um das zweite Ziel zu erreichen, wurde eine Serie von Pyridinium-5-markierten Histaminderivaten hergestellt. Hierbei wurde das relativ kleine Fluorophor Pyrylium-5 (Py-5, 4.10) gewählt, da dieses eine einfache Fluoreszenzmarkierung hin zu Liganden mit optimalen spektralen Eigenschaften für NLuc-basierte BRET-Assays ermöglicht. Insbesondere für das Imbutamin UR-DEBa242 (4.26) und das Impentamin 4.27 ergaben sich an den hH3,4 Rezeptoren hohe Affinitäten im sub- bis zweistellig nanomolaren Bereich. Darüber hinaus zeigte 4.26 agonistische bzw. antagonistische Aktivität im ein- bis zweistelligen nanomolaren Bereich am hH3R (partieller Agonist), am hH4R (inverser Agonist) und am mH4R (inverser Agonist/Antagonist). Unter Verwendung der Konfokalmikroskopie erwies sich 4.26 auch als geeignetes molekulares Werkzeug für den Nachweis des hH4R in lebenden Zellen. In NLuc-basierten BRET-Assays ermöglicht 4.26 vergleichende robuste Bindungsstudien an den NLuc-hH3 und NLuc-h/mH4 Rezeptoren [pKd (sat): 8,8, 7,8 bzw. 7,2; vergleichsweise schnelle Kinetik (≈2 Min.)].
Fazit: 3[H]3.46 und 4.26 sind die ersten hochaffinen Radio- und Fluoreszenzliganden, die robuste und speziesübergreifende Bindungsstudien an den H4R Orthologen ermöglichen. Daher können sie – im Hinblick auf Nagermodelle – für pharmakologische Untersuchungen am H4R eingesetzt werden (z.B. Frühphasencharakterisierung neuer molekularer Werkzeuge oder potenzieller Wirkstoffkandidaten in Radioligand- oder BRET-basierten Bindungsassays). Darüber hinaus kann 4.26 zu Untersuchungen bezüglich der Expression des H4R beitragen, indem es die Lokalisierung des hH4R in lebenden Zellen ermöglicht. Da 4.26 einfach zu synthetisieren, umfassend charakterisiert und für NLuc-basierte BRET-Assays ideal geeignet ist, stellt es schließlich eine überlegene Alternative zu den käuflich erhältlichen Fluoreszenzliganden dar, die bisher in BRET-basierten Bindungsassays an den NLuc-hH3,4 Rezeptoren Anwendung fanden.
Metadata last modified: 18 Oct 2021 10:50
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