| License: Creative Commons Attribution 4.0 (5MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-438124
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.43812
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 September 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Michael Rehli |
| Date of exam: | 16 September 2020 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | DNA Demethylation, monocytes, dendritic cells |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 43812 |
Abstract (English)
Epigenetic processes, such as DNA (de)methylation and chromatin remodeling are fundamental for hematopoietic cell differentiation and lineage specification. Hence, their dysregulation is associated with many hematological malignancies. In this thesis, the analyses were focused on DNA demethylation processes during monocyte (MO) to immature dendritic cell (iDC) differentiation in the presence of ...
Abstract (English)
Epigenetic processes, such as DNA (de)methylation and chromatin remodeling are fundamental for hematopoietic cell differentiation and lineage specification. Hence, their dysregulation is associated with many hematological malignancies.
In this thesis, the analyses were focused on DNA demethylation processes during monocyte (MO) to immature dendritic cell (iDC) differentiation in the presence of the cytokines IL4 and GM-CSF. Due to the absence of cell proliferation in this system, we were able to investigate TET-mediated active demethylation events occurring in a replication-independent context.
In hematopoietic cells, comprising MO and MO-derived cells, the TET2 enzyme is the main hydroxylase catalysing the initial oxidation of 5-methylcytosine (5mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) and likely the remaining oxidative steps as well. In this thesis, the TET2 gene was transiently knocked-down in MO using a well-established siRNA-mediated approach and its functional consequences during iDC differentiation were assessed.
Overall, TET2 depletion was associated with very mild effects on iDC differentiation, transcriptional programs and chromatin remodeling processes. Nevertheless, the data was reproducible among donors and corroborated the importance of TET2-mediated active DNA demethylation processes during MO differentiation.
Based on preliminary genome-wide methylation analyses in MO and iDCs, 7610 iDC-specific differentially methylated regions (DMRs) were identified. These regions were characterized by a progressive active DNA demethylation (5hmC enrichment) and an increase in chromatin accessibility.
Since we were mostly interested on differentiation-associated processes, the analyses were centered on transcription factors (TFs) enriched across DMRs and strongly induced in iDCs, such as IRF4 and EGR2. Consequently, both TFs were individually and transiently knocked-down in MO and their effects on iDC differentiation and associated epigenetic processes were determined.
IRF4 depletion prevented the differentiation of iDC, and instead cells acquired a macrophage-like morphology confirming previous mouse work244. Interestingly, we found that IRF4 might be involved in open chromatin at its binding sites regardless of changes in DNA demethylation, as reflected by the reduced chromatin accessibility and the minor effects on DNA methylation upon its depletion.
Remarkably, this work is the first to describe an essential role of EGR2 in IL4/GM-CSF-mediated MO differentiation. Indeed, data showed a strong impact of EGR2 depletion on cell morphology and viability as well as profound changes in iDC transcriptional programs.
Besides its importance on MO biology, EGR2 is implicated in active DNA demethylation and chromatin remodeling processes as indicated by iDC DMRs that remained methylated and failed to gain accessibility upon EGR2-silencing.
Notably, the presence of a methylation footprint in the EGR2 motif associated with its ability to bind methylated DNA, suggest that the epigenetic pioneer EGR2 can target de novo demethylation processes at its transient and stable binding sites. In fact, co-immunoprecipitation data showed an interaction between EGR2 and TET2, emphasizing the EGR2 role in targeting the DNA demethylation machinery.
In summary, this thesis provides new insights into dynamic epigenetic changes through IL4/GM-CSF-mediated MO differentiation. Accordingly, we identified key regulators on MO biology and differentiation-associated epigenetic processes, specifically IRF4 and EGR2. Importantly, EGR2 was found to recruit TET2 to its binding sites even before chromatin opening or TF binding detection, suggesting that at certain iDC DMRs active DNA demethylation and chromatin accessibility changes are uncoupled. In addition, this work demonstrated that DNA methylation-spikes (identified in EGR2 as well as other consensus motifs of TFs) are cell type-specific and protected from demethylation by bound key epigenetic pioneer factors.
Translation of the abstract (German)
Epigenetische Prozesse wie DNA (De)Methylierung und „Chromatin-Remodeling“ sind für die Differenzierung hämatopoetischer Zellen und für ihre spezifische Zellabstammung grundlegend. Daher ist deren Dysregulation mit vielen hämatologischen Malignitäten verbunden. Diese Doktorarbeit beschreibt in wesentlichen Zügen die DNA-Demethylierungsprozesse während der IL4 / GM-CSF-gesteuerten Differenzierung ...
Translation of the abstract (German)
Epigenetische Prozesse wie DNA (De)Methylierung und „Chromatin-Remodeling“ sind für die Differenzierung hämatopoetischer Zellen und für ihre spezifische Zellabstammung grundlegend. Daher ist deren Dysregulation mit vielen hämatologischen Malignitäten verbunden.
Diese Doktorarbeit beschreibt in wesentlichen Zügen die DNA-Demethylierungsprozesse während der IL4 / GM-CSF-gesteuerten Differenzierung von Monozyten (MO) zu inaktiven dendritischen Zellen (iDCs). Da die Zellen in diesem System nicht proliferieren, konnten wir die enzymatischen TET-vermittelten aktiven Demethylierungsereignisse untersuchen, die in einem Replikations-unabhängigen Kontext auftreten. In hämatopoetischen Zellen, welche unter anderem die MO- und MO-abstammenden Zellen umfassen, ist das TET2-Enzym hauptsächlich die Hydroxylase, welche die anfängliche Oxidation von 5 mC zu 5 hmC und wahrscheinlich auch die verbleibenden Oxidationsschritte (5fC und 5caC) katalysiert. In dieser Doktorarbeit wurde das TET2-Gen in MO vorübergehend mittels siRNA unterdrückt und dessen funktionelle Konsequenz während der iDC-Differenzierung untersucht.
Insgesamt hatte die TET2-Depletion sehr geringe Auswirkungen auf die iDC-Differenzierung, das Transkriptionsprogramm und die Chromatin-Remodeling-Prozesse. Dennoch waren die Daten unter den Spendern reproduzierbar und bestätigten die Bedeutung von TET2-vermittelten aktiven DNA-Demethylierungsprozessen während der MO-Differenzierung.
Basierend auf vorläufigen genomweiten Methylierungsanalysen in MO und iDCs wurden 7610 iDC-spezifische differentiell methylierte Regionen (DMRs) identifiziert. Diese Regionen waren durch eine fortschreitende aktive Demethylierung der DNA (5hmC-Anreicherung) und eine erhöhte Zugänglichkeit von Chromatin (Euchromatin) charakterisiert.
Da wir hauptsächlich an differenzierungsassoziierten Prozessen interessiert waren, wurden diejenigen Transkriptionsfaktoren (TFs), welche in den iDC-DMRs angereichert sind, analysiert. Zusätzlich zeigten die TFs IRF4 und EGR2 eine starke Induktion in iDC. Folglich wurden beide TFs in MO einzeln und vorübergehend unterdrückt und dessen Auswirkungen auf die iDC-Differenzierung und die damit verbundenen epigenetischen Prozesse bestimmt.
Die IRF4-Depletion verhinderte den iDC-Differenzierungsprozess und die Zellen erwarben stattdessen eine makrophagenähnliche Morphologie, was auch in früheren Arbeiten in Mausmodellen gezeigt werden konnte. Interessanterweise wurde beobachtet, dass IRF4, unabhängig von Änderungen in der DNA-Demethylierung, an seinen Bindungsstellen an der Regulierung von offenem Chromatin beteiligt sein könnte. Dies zeigte sich zusätzlich in der verringerten Zugänglichkeit des Chromatins und den geringen Auswirkungen auf die DNA-Methylierung nach IRF4 Gen-Knock-down.
Bemerkenswerterweise ist diese Arbeit die erste, die eine wesentliche Rolle von EGR2 bei der IL4 / GM-CSF-gesteuerten MO-Differenzierung beschreibt. In der Tat zeigten die Daten einen starken Einfluss der EGR2-Depletion auf die Zellmorphologie und -lebensfähigkeit sowie signifikante Veränderungen in den iDC-Transkriptionsprogrammen.
Neben seiner Bedeutung für die MO-Biologie ist EGR2 an aktiven DNA-Demethylierungs- und Chromatin-Remodellierungsprozessen beteiligt, was durch eine Reihe von charakteristischen iDCs-DMRs angezeigt wurde. Diese blieben methyliert und erlangten auch nach EGR2-Stummschaltung keine Zugänglichkeit.
Insbesondere das Vorhandensein einer spezifischen DNA-Methylierung im EGR2-Motiv (im Einklang mit seiner Fähigkeit, methylierte DNA zu binden) schlagen vor, dass die EGR2 zu einem „epigenetischen Pionier“ am Beginn von De-novo-Demethylierungsprozessen an seinen transienten und stabilen Bindungsstellen.
Tatsächlich zeigten die CoIP-Daten eine Interaktion zwischen EGR2 und TET2, was die Rolle von EGR2 als Teil der DNA-Demethylierungsmaschinerie unterstreicht.
Zusammenfassend liefert diese Arbeit neue Einblicke in dynamische DNA-Methylierungsänderungen während der IL4 / GM-CSF-gesteuerten MO-Differenzierung. Dementsprechend wurden Hauptregulatoren für die MO-Biologie und differenzierungsassoziierte epigenetische Prozesse identifiziert, insbesondere IRF4 und EGR2. Es wurde festgestellt, dass EGR2 TET2 bereits vor dem Öffnen des Chromatins oder dem Nachweis der TF-Bindung an seine Bindungsstellen rekrutiert, was darauf hindeutet, dass bei bestimmten iDC-DMRs Änderungen der aktiven DNA-Demethylierung und der Zugänglichkeit des Chromatins entkoppelt sind. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass DNA-Methylierungsanreicherungen, die möglicherweise den Methylierungsfußabdruck an EGR2-Bindungsstellen widerspiegeln, zelltypspezifisch sind und durch gebundene epigenetische Schlüsselpionierfaktoren vor Demethylierung geschützt werden können.
Metadata last modified: 17 Sep 2021 08:43
Owner only: item control page
Download Statistics