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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-448643
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.44864
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 10 Februar 2022 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Rudolf Fuchshofer |
| Tag der Prüfung: | 10 Februar 2021 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Humananatomie und Embryologie |
| Stichwörter / Keywords: | glaucoma; miRNA; Nitric Oxide |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 44864 |
Zusammenfassung (Englisch)
Glaucoma is one of the leading causes of blindness in the western world (Quigley 1996; Resnikoff et al. 2004). Its pathogenesis is characterized by a chronic degenerative neuropathy leading to the loss of axons of the retinal ganglion cells (Allingham et al. 2009; Kwon et al. 2009) and Primary Open Angle Glaucoma (POAG) is its most prevalent form. Patients suffer from visual field loss, ending in ...
Zusammenfassung (Englisch)
Glaucoma is one of the leading causes of blindness in the western world (Quigley 1996; Resnikoff et al. 2004). Its pathogenesis is characterized by a chronic degenerative neuropathy leading to the loss of axons of the retinal ganglion cells (Allingham et al. 2009; Kwon et al. 2009) and Primary Open Angle Glaucoma (POAG) is its most prevalent form. Patients suffer from visual field loss, ending in total blindness if not appropriately treated.
Intraocular pressure (IOP) has been found to be a main risk factor for POAG (Gordon et al. 2002; Higginbotham et al. 2004). During the pathogenesis of POAG, the outflow of aqueous humor (AH) is reduced due to an increased outflow resistance in the JCT of the TM (Grant 1963; Johnson 2006). Even if molecular mechanisms causing this increase are still unclear, changes in amount and quality of extracellular matrix (ECM) are likely to be involved (Lütjen-Drecoll et al. 1986; Rohen et al. 1993). Connective Tissue Growth Factor (CTGF) has been found to be elevated in the AH (Browne et al. 2011; Fahmy et al. 2008) as well as in SC cells of POAG patients (Overby et al. 2014), and potent to induce ECM expression in TM cells (Junglas et al. 2009). A CTGF overexpressing mouse model, developing elevated IOP and axon loss over time, underlined the role of CTGF in the pathogenesis of POAG (Junglas et al. 2012). Next to changes in the composition of the ECM in the JCT, endothelial cells of Schlemm’s Canal (SC) inner wall seem to have the potential to modulate outflow resistance (Stamer et al. 2015). A negative correlation of pore forming ability and SC cell stiffness was found (Overby et al. 2014). If that pore forming ability becomes disrupted in POAG, it would lead to impaired AH outflow and IOP elevation.
When IOP increases, it results in increased fluid shear stress for the affected cells of the outflow pathway (Ethier et al. 2004; Stamer et al. 2011). Under healthy conditions, increasing IOP leads to increasing NO signaling and - by its cell relaxing effect - to an increased outflow facility (Buys et al. 2014). Under glaucomatous conditions, SC cells stiffen (Overby et al. 2014; Vahabikashi et al. 2019) and a dysregulation of NO release is suggested to result in ocular hypertension (Emam et al. 2014). Reducing cell stiffness trough cell relaxation is therefore an optional aim to treat POAG. Therefore, DETA-NO was chosen as exogenous NO donor in this study to investigate its effect on outflow cells in vitro.
Micro ribonucleic acids (miRNAs) have emerged as key regulators of gene expression by post-transcriptionally binding target messenger RNA (mRNA) according to their nucleotide sequences (Wienholds and Plasterk 2005; Krol et al. 2010; Huntzinger and Izaurralde 2011). Alterations in miRNAs have been implicated in many different diseases (Esteller 2011; Gutschner and Diederichs 2012) and it just started to investigate its role in the pathogenesis of POAG. In the present study, the premise was that aberrant biomechanical behavior of outflow cells might be due to altered expression of miRNAs that are associated to the NO regulatory system.
The present study investigated a glaucoma mouse model overexpressing CTGF. It was found that macroglia activation and IOP increase are specific for the transgenic βB1-CTGF mice, independent on their genetic background. A potential antagonist of the CTGF effects was investigated by treating SC cells with exogenous NO. There, DETA-NO treatment not only reduced the expression of CTGF and ECM components but also caused a significant reduction of cell stiffness. Furthermore, in vitro flow conditions induced NO production.
By a miRNA-microarray, 39 miRNAs associated to the NO signaling pathway were found to be differentially expressed in healthy and glaucomatous SC cell strains. By correlation analysis, four of them were found to have a positive correlation of miRNA abundance and cell stiffness. For miR-222-3p and miR-455-3p, the increase was confirmed and miRNA alteration by transfection experiments led to significant impact on CTGF expression. To further investigate a potential delivery system for miRNAs towards outflow tissue, the distribution of gold-core nanoparticles (AuNPs) within the anterior chamber was assessed after ex vivo perfusion of porcine eyes and gold content of ciliary body, cornea, iris, lens, and the TM was analyzed. ICP-MS analysis exhibited that independent on AuNP size and surface, most gold was targeted to the TM. Therefore, NPs can be used as delivery system to specifically target therapeutic agents to outflow tissue.
By revealing the effect of alterations in NO signaling and miRNA abundance on glaucoma-associated factors, the molecular mechanisms underlying glaucoma could be better understood.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Beim Glaukom handelt es sich um eine der häufigsten Erblindungsursachen in der westlichen Welt (Quigley 1996; Resnikoff et al. 2004). Seine Pathogenese ist durch eine chronische, degenerative Neuropathie charakterisiert, welche mit einem Verlust der Axone der retinalen Ganglienzellen einhergeht (Allingham et al. 2009; Kwon et al. 2009). Das Primäre Offenwinkelglaukom (POWG) stellt dabei die ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Beim Glaukom handelt es sich um eine der häufigsten Erblindungsursachen in der westlichen Welt (Quigley 1996; Resnikoff et al. 2004). Seine Pathogenese ist durch eine chronische, degenerative Neuropathie charakterisiert, welche mit einem Verlust der Axone der retinalen Ganglienzellen einhergeht (Allingham et al. 2009; Kwon et al. 2009). Das Primäre Offenwinkelglaukom (POWG) stellt dabei die häufigste Form dar und Patienten leiden unter Gesichtsfeldverlusten, die in totaler Erblindung enden können, falls sie nicht behandelt werden.
Als Hauptrisikofaktor, am POWG zu erkranken, gilt der intraokuläre Druck (IOD) (Gordon et al. 2002; Higginbotham et al. 2004). Bei der Pathogenese des POWGs ist der Abfluss des Kammerwassers (KW) aufgrund eines erhöhten Abflusswiderstands in der juxtakanalikulären Region des Trabekelwerks (TW) reduziert (Grant 1963; Johnson 2006). Auch wenn die molekularen Mechanismen, die diesen Anstieg verursachen, noch nicht umfassend geklärt sind, gelten Veränderungen in der Qualität und Quantität der extrazellularen Matrix (EZM) als wahrscheinlich (Lütjen-Drecoll et al. 1986; Rohen et al. 1993). Der Wachstumsfaktor Connective Tissue Growth Factor (CTGF) wurde in erhöhten Mengen im KW (Browne et al. 2011; Fahmy et al. 2008) sowie in Endothelzellen des Schlemmkanals (SC) von POWG-Patienten gefunden (Overby et al. 2014) und gilt als potent, die Expression von EZM in TW-Zellen zu induzieren (Junglas et al. 2009). Da ein Mausmodel, welches CTGF überexprimiert, mit der Zeit einen erhöhten IOD sowie einen Axonverlust entwickelt, wird die Rolle von CTGF bei der Pathogenese des POWGs unterstrichen (Junglas et al. 2012). Neben Änderungen der Zusammensetzung der EZM im juxtakanalikulären TW scheinen die Endothelzellen des SCs das Potential zu besitzen, den Abflusswiderstand zu modulieren (Stamer et al. 2015). Da eine negative Korrelation zwischen der Fähigkeit, Poren auszubilden, und der Rigidität von SC-Zellen gefunden wurde (Overby et al. 2014), könnte es bei der Pathogenese des POWGs dort zu einem Ungleichgewicht kommen und einen beeinträchtigten KW-Abfluss und folglich einen erhöhten IOD nach sich ziehen.
Wenn der IOD steigt, resultiert dies in einem erhöhten Scherstress für die betroffenen Zellen (Ethier et al. 2004; Stamer et al. 2011). Während im gesunden Auge ein erhöhter IOD zu einem verstärkten Stickstoffmonoxid (nitric oxide, NO) Signaling und - durch dessen relaxierenden Effekt auf die Zellen - zu einer erhöhten Abflussfazilität führt (Buys et al. 2014), werden die SC-Zellen unter glaukomatösen Bedingungen rigider (Overby et al. 2014; Vahabikashi et al. 2019) und eine Dysregulation der NO-Freisetzung scheint in okularer Hypertonie zu resultieren (Emam et al. 2014). Das Reduzieren der zellulären Rigidität durch Zellrelaxation schein daher ein potentieller Ansatz zu sein, das POWG zu behandeln. Daher wurde DETA-NO als exogener NO-Donor verwendet, um seinen Effekt auf SC- und TW-Zellen in vitro zu untersuchen.
Mikroribonukleinsäuren (miRNAs) haben sich als Schlüsselmoleküle der post-transkriptionellen Genregulation herausgestellt, da sie Ziel-messengerRNA sequenzspezifisch binden (Wienholds and Plasterk 2005; Krol et al. 2010; Huntzinger and Izaurralde 2011). Veränderungen in der miRNA-Homöostase werden mit zahlreichen Krankheiten in Verbindung gebracht (Esteller 2011; Gutschner and Diederichs 2012) und man hat gerade erst begonnen, ihre Rolle in der Pathogenese des POWGs zu erforschen. In der hier präsentierten Arbeit wurde untersucht, ob das veränderte biomechanische Verhalten der Zellen auf einer veränderten Expression von miRNAs beruhen könnte, welche dem NO-Regulationssystem zugeordnet werden.
Die hier präsentierte Studie untersuchte außerdem ein Glaukom-Mausmodell, welches CTGF überexprimiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass es in den transgenen Tieren - unabhängig ihres genetischen Hintergrunds - zu einer Aktivierung der Makroglia sowie zu einem Anstieg des IODs kommt. Zusätzlich wurde ein potenzieller Antagonist des CTGF-Effekts untersucht, indem SC-Zellen mit exogenem NO behandelt wurden. So konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit DETA-NO nicht nur die Expression von CTGF sowie Komponenten der EZM reduziert, sondern auch zu einer signifikant reduzierten Zellrigidität führt. Schließlich wurde gezeigt, dass eine in vitro Inkubation unter Fluss die NO-Produktion induziert.
Anhand eines miRNA-Arrays wurden 39 miRNAs ermittelt, welche dem NO-Signalweg zugeordnet werden, und von den gezeigt werden konnte, dass sie differenziell zwischen gesunden und glaukomatösen SC-Zelllinien exprimiert werden. Durch eine Korrelationsanalyse konnte für vier miRNAs ein positiver Zusammenhang zwischen miRNA-Abundanz und Zellrigidität ermittelt werden. Für miR-222-3p und miR-455-3p konnte dieser Anstieg validiert und durch Transfektionsexperimente gezeigt werden, dass die CTGF-Expression signifikant beeinträchtigt ist. Um Nanopartikel (NP) zu einem potenziellen Verabreichungs-Tool für miRNA als Therapeutika zu entwickeln, wurde deren Verteilung in der vorderen Augenkammer analysiert. Dazu wurden NP mit einem Gold-Kern verwendet, die in ex vivo Perfusionsexperimenten von Schweineaugen eingesetzt wurden, und nach denen der Goldgehalt von Ziliarkörper, Kornea, Iris, Linse und TW analysiert wurde. Mit Hilfe von massenspektrometrischen Untersuchungen (inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS) konnte gezeigt werden, dass unabhängig von der Größe und der Oberflächenbeschaffenheit der NP das meiste Gold im TW zu finden war. Damit haben sich NP hervorgetan, als Träger von Therapeutika diese spezifisch ans Zielgewebe zu adressieren.
Durch Untersuchungen des Effekts von Veränderungen im NO-Signaling und der miRNA-Abundanz auf Gene, die mit der Pathogenese des POWGs assoziiert sind, könnte ein Beitrag geleistet werden, die molekularen Mechanismen besser zu verstehen, die dem Glaukom zugrunde liegen.
Metadaten zuletzt geändert: 10 Feb 2022 07:15
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