Development and Application of a High-Resolution Flow Injection Analysis Fourier Transform Mass Spectrometry (FIA-FTMS) Method to Identify and Quantify Lipids in Human Fecal Samples

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-452758
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.45275

Ertl, Verena

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 30 Mrz 2021 06:39

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	30 März 2021
Begutachter (Erstgutachter):	PD Dr. Gerhard Liebisch
Tag der Prüfung:	19 März 2021
Institutionen:	Medizin > Lehrstuhl für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin
Stichwörter / Keywords:	Lipidomics, Microbiome, Feces, Triglyceride, Diglyceride, High Resolution Mass Spectrometry
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	45275

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Zusammenfassung (Englisch)

Zusammenfassung (Englisch)

The intestinal microbiome plays an important role in human health and disease and fecal materials reflect the microbial activity. Thus, analysis of fecal metabolites provides insight into metabolic interactions between gut microbiota and host organism.
In this work, we applied flow injection analysis coupled to Fourier transform mass spectrometry (FIA-FTMS) to identify and quantify lipid species in human fecal samples in high throughput. Fecal homogenates were subjected to lipid extraction according to the protocol by Bligh and Dyer, and analyzed by FIA-FTMS. The method was developed using a Q Exactive hybrid Orbitrap with a maximum resolution of 140,000 at m/z 200, a short analysis time of less than four minutes and an automated data evaluation using the ALEX software and self-programmed macros in Microsoft Excel.
The analysis of different subjects revealed a vast heterogeneity of lipid species abundance. The majority of samples displayed prominent signals of triacylglycerol (TG) and diacylglycerol (DG) species that could be verified by MS2 spectra. Therefore, we focused on the quantification of TG and DG. Method validation included limit of quantification, linearity, evaluation of matrix effects, recovery, and reproducibility. The validation experiments demonstrated the suitability of the method, with exception of approximately 10% of samples in which we observed CVs higher than 15%. Impaired reproducibility was related to sample inhomogeneity and could not be improved by additional sample preparation steps. Additionally, these experiments demonstrated that, compared to aqueous specimens, samples containing isopropanol showed higher amounts of DG, presumably due to lysis of bacteria and increased TG lipolysis. These effects were sample-specific and substantiate the high heterogeneity of fecal materials as well as the need for further evaluation of pre-analytic conditions.
Despite optimization of ionisation by addition of methylamine FIA-FTMS of fecal lipid extracts in negative ion mode revealed low signals for lyso-phospholipids and glycerophospholipids that could not be verified. This suggests that analysis of these lipid classes requires more sensitive methods like LC-MS.
In summary, FIA-FTMS offers a fast and accurate tool to quantify DG and TG species and is suitable to provide insight into the fecal lipidome and its role in health and disease.

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

Für die menschliche Gesundheit sowie auch für Krankheiten spielt das Darmmikrobiom eine wichtige Rolle. Fäkalien spiegeln dabei die mikrobielle Aktivität wider. Die Analyse der fäkalen Metaboliten liefert daher Einblicke in die metabolischen Wechselwirkungen zwischen Darmmikrobiota und Wirtsorganismus.
In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer Fließ-Injektion-Analyse beschrieben, welche mit einer Fourier-Transform-Massenspektrometrie-Messung (FIA-FTMS) gekoppelt ist, um Lipidspezies in menschlichen Fäkalien mit einem hohen Probendurchsatz zu identifizieren und quantifizieren. Fäkale Homogenate wurden gemäß dem Protokoll von Bligh und Dyer einer Lipidextraktion unterzogen und mittels FIA-FTMS analysiert. Die Methode wurde an einer Q Exactive hybrid Orbitrap mit einer maximalen Auflösung von 140,000 bei m/z 200 entwickelt. Kurze Messzeiten von weniger als vier Minuten und eine automatisierte Datenauswertung unter Verwendung der ALEX-Software und selbstprogrammierter Makros in Microsoft Excel ermöglichten einen hohen Probendurchsatz.

Die Analyse von Fäkalien verschiedener Probanden ergab eine große Heterogenität der Lipidkonzentrationen. In der Mehrzahl der Proben wurden Triacylglycerin- (TG) und Diacylglycerin-Spezies (DG) detektiert, welche durch MS2-Spektren verifiziert werden konnten. Daher konzentrierte sich die Quantifizierung hauptsächlich auf diese beiden Lipidklassen. Die Methodenvalidierung umfasste Experimente zur Nachweisgrenze, Linearität, Bewertung von Matrixeffekten, Wiederfindung und Reproduzierbarkeit. Die durchgeführten Validierungsexperimente zeigten eine gute Reproduzierbarkeit, mit Ausnahme von etwa 10% der Proben, bei welchen ein CV von mehr als 15% beobachtet wurde. Die beeinträchtigte Reproduzierbarkeit war auf die Probeninhomogenität zurückzuführen und konnte auch durch zusätzliche Probenvorbereitungsschritte nicht verbessert werden. Zudem zeigten diese Experimente höhere Mengen an DG-Spezies, wenn die Proben in 2-Propanol statt in wässriger Lösung homogenisiert wurden, was sich vermutlich auf die Lyse von Bakterien und eine erhöhte TG-Lipolyse zurückführen lässt. Diese Effekte waren probenspezifisch und untermauerten die hohe Heterogenität der fäkalen Materialien sowie die Notwendigkeit einer weiteren Evaluierung der präanalytischen Bedingungen.
Eine Messung im negativen Ionenmodus durch Zugabe von Methylamin ergab nur sehr niedrige Signale für Lyso-Phospholipide und Glycerophospholipide, welche nicht verifiziert werden konnten. Hieraus lässt sich schließen, dass für die Analyse dieser Lipidklassen empfindlichere Methoden wie z.B. LC-MS benötigt werden.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass FIA-FTMS ein schnelles und genaues Verfahren zur Quantifizierung von DG- und TG-Spezies darstellt, welches geeignet ist, einen Einblick in das fäkale Lipidom zu geben und dessen Rolle in Gesundheit und Krankheit zu entschlüsseln.

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