| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (20MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-464320
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.46432
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 4 August 2021 |
| Begutachter (Erstgutachter): | apl. Prof. Winfried Hausner |
| Tag der Prüfung: | 14 Juli 2021 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) |
| Stichwörter / Keywords: | archaea,transcriptomics, genomics, Nanopore, pyrococcus, bidirectional, transcription, rRNA, modifications, CopR |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 46432 |
Zusammenfassung (Englisch)
Archaea nowadays are acknowledged for representing the second domain of life and for playing significant roles in the Earth ́s biogeochemical cycles. Before their initial discovery by Carl Woese and colleagues in the late 1970s, Archaea have not been recognised and erroneously confused with look-alike Bacteria under the microscope for decades. Since their classification as the third primary ...
Zusammenfassung (Englisch)
Archaea nowadays are acknowledged for representing the second domain of life and for playing significant roles in the Earth ́s biogeochemical cycles. Before their initial discovery by Carl Woese and colleagues in the late 1970s, Archaea have not been recognised and erroneously confused with look-alike Bacteria under the microscope for decades. Since their classification as the third primary “kingdom” in 1990, not only their position in the universal tree of life has changed, defining the archaeal ancestry of Eukaryotes. Also, the knowledge about their ecology, diversity, evolution and molecular principles has been extended tremendously. Notably, it has been revealed that on the molecular level, Archaea share remarkably striking characteristics with both Eukarya and Bacteria, with transcription as one of the prime examples. Here, we have primarily been interested in the genome and transcriptome architecture, the regulatory roles of transcription factors and post-transcriptional mechanisms in the hyperthermophilic model archaeon Pyrococcus furiosus.
To obtain the most accurate and informative background for further studies, we re- sequenced the culture collection strain DSM 3638 employing state-of-the-art hybrid Illumina and PacBio DNA sequencing and extensively expanded the annotation on the transcript level by using a differential RNA sequencing approach. Digestion of all non 5 ́- triphosphorylated transcripts by a Terminator-exonuclease allowed us to specifically enrich primary transcripts. The redefinition of the transcriptional landscape of P. furiosus included the genome-wide detection of transcription start sites, promoter architectures, sense- and antisense-RNAs. Interestingly, we discovered bidirectional transcription from symmetric promoters as an extensive source of antisense transcription, which is presumably a widespread feature of archaeal transcription. Additionally, we could prove that despite the relatively high abundance of insertion sequences in the 2 Mbp genome, the handling of a lab culture for two years did not lead to genomic rearrangements. Although we did not specifically challenge the genomic integrity, this still suggests that the genome is more stable than previously anticipated, which is an essential prerequisite for the comparability and feasibility of future genome-wide studies in P. furiosus. For rapid and cost-efficient re- sequencing of archaeal strains, we established 3rd generation long-read Nanopore sequencing technology in the lab, which allowed us to sequence the lab strain with high consensus accuracy.
Next, we established a protocol for direct RNA sequencing in prokaryotes using the Nanopore technology, which is currently the only option for single-molecule sequencing of transcripts in their native context. The plethora of transcriptional and post-transcriptional events and features are usually tackled by short-read sequencing approaches that specifically have to be tailored to the respective research question by making adaptions to the library preparation protocol or by chemical treatment. In contrast, we evaluated the potential of native RNA sequencing to address multiple transcriptomic features simultaneously in a bacterial (Escherichia coli) and archaeal (Haloferax volcanii, P. furiosus) model organisms. Performing meta-data and single-molecule analysis we could (re-)annotate large transcriptional units and map transcription boundaries. Besides, we showed that long reads are a valuable tool for heterogeneous 3 ́-end detection and that diverse termination mechanisms occur in Archaea. Next, we used the single-molecule potential of Nanopore reads for the identification of previously known and unknown intermediates in the poorly understood rRNA maturation pathway in Archaea. Moreover, we were able to detect RNA base modifications in the form of systematic basecalling errors and shifts in the ionic current, which allowed us to follow the relative timely order of KsgA- dependent di-methylation and N4-cytidine acetylation in mature and precursor 16S rRNAs in archaeal species.
Third, using the new reference genome of P. furiosus, we performed an integrative RNA-seq and ChIP-seq based approach to decipher the function of the transcriptional regulator CopR during copper detoxification in P. furiosus. To get a global view on the transcriptomic response and find components of the CopR-regulon, we performed differential gene expression analysis and ChIP-seq analysis after copper shock. We discovered that CopR, which is essential in copper detoxification, binds to the upstream regions of highly copper-induced genes, that all share a common palindromic motif. Additionally, negative-stain transmission electron microscopy and image analysis by 2D class averaging revealed that CopR binds to DNA in an octameric conformation similar to other factors of the Lrp family. Finally, we proposed a model for allosteric regulation of CopR upon copper-binding and revealed different layers of copper detoxification in P. furiosus.
The findings of the studies that make up this thesis contribute to a deeper understanding of basic and regulatory principles of transcription in Archaea and update the genomic and transcriptomic landscape of P. furiosus. Also, the application of Nanopore- based native RNA sequencing not only represents a significant extension of the transcriptomic toolbox in prokaryotes but also provided us with a wealth of information, especially regarding transcriptional and post-transcriptional events during rRNA maturation.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Archaeen werden aktuell als zweite Domäne des Lebens und als wichtiger Bestandteil aller biogeochemischen Abläufe der Erde anerkannt. Vor ihrer Entdeckung durch Carl Woese und Kollegen in den späten 1970er Jahren, wurden sie allerdings nicht wahrgenommen und fälschlicherweise für Bakterien gehalten, da diese meist anhand mikroskopischer Merkmale nicht voneinander zu unterscheiden sind. Seit ihrer ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Archaeen werden aktuell als zweite Domäne des Lebens und als wichtiger Bestandteil aller biogeochemischen Abläufe der Erde anerkannt. Vor ihrer Entdeckung durch Carl Woese und Kollegen in den späten 1970er Jahren, wurden sie allerdings nicht wahrgenommen und fälschlicherweise für Bakterien gehalten, da diese meist anhand mikroskopischer Merkmale nicht voneinander zu unterscheiden sind. Seit ihrer Klassifizierung als drittes primäres „Königreich“ im Jahr 1990 hat sich nicht nur ihre Stellung im universellen Baum des Lebens geändert und die archaische Abstammung der Eukaryoten definiert. Auch das Wissen über ihre Ökologie, Diversität, Evolution und Molekularbiologie wurde enorm erweitert und vertieft. Bemerkenswerterweise teilen Archaeen auf molekularer Ebene erstaunlich viele Charakteristika mit Eukaryoten und Bakterien, wobei der Vorgang der Transkription als Musterbeispiel gilt.
Diese Arbeit beschäftigt sich vor allem mit der grundlegenden Architektur des Genoms und Transkriptoms, der regulatorischen Rolle von Transkriptionsfaktoren und post-transkriptionellen Mechanismen im hyperthermophilen Modellorganismus Pyrococcus furiosus. Um für zukünftige Studien eine möglichst exakte und informationsreiche Grundlage zu schaffen, wurde zunächst das Genom des Typ Stammes DSM 3638 durch einen Hybridansatz aus Illumina und PacBIO Sequenzierung bestimmt. Außerdem wurde die Annotation auf dem Transkript-Level durch einen differentiellen RNA Sequenzieransatz erweitert. Der Verdau aller Transkripte ohne 5 ́-Triphosphat durch eine Terminatorexonuklease erlaubte uns das primäre Transkriptom von P. furiosus neu zu definieren, inklusive der genomweiten Bestimmung aller Transkriptionsstarts, Promoter- Architekturen, und der Beschreibung von sense und antisense RNAs. Interessanterweise konnten wir feststellen, dass symmetrische Promotoren eine häufige Ursache für die bidirektionale Transkription von sense und antisense RNAs sind, was ein genereller Mechanismus in Archaeen zu sein scheint. Außerdem hat sich gezeigt, dass ein normaler Umgang mit einer Laborkultur über einen Zeitraum von zwei Jahren nicht zu einer Umgruppierung von Genen führt, obwohl es sehr viele IS-Elemente im 2 Millionen Basenpaare großen Genom von P. furiosus gibt. Obwohl wir die Integrität nicht in besonderer Weise herausgefordert haben, bedeutet dies dennoch, dass das Genom stabiler ist als bisher angenommen, was eine Grundvoraussetzung für die Vergleichbarkeit, Reproduzierbarkeit und damit die Durchführbarkeit von zukünftigen genomweiten Studien in Pyrococcus darstellt. Für eine schnelle und kosteneffiziente Re-Sequenzierung von archaeellen Stämmen wurde die Nanopore Technologie im Labor etabliert. Dies ist eine Sequenziermethode der dritten Generation, die es uns, dank der Eigenschaft sehr lange zusammenhängende Sequenzstücke generieren zu können, ermöglicht hat, den Laborstamm mit hoher Konsensus-Genauigkeit zu sequenzieren.
Darauf aufbauend wurde ein Protokoll für die direkte Sequenzierung von RNA in Prokaryoten basierend auf der Nanopore Technologie entwickelt, was aktuell noch die einzige Möglichkeit darstellt, Einzelmolekülsequenzierung im nativen Kontext durchzuführen. Die Fülle an transkriptionellen und posttranskriptionellen Ereignissen und Merkmalen auf genomweiter Ebene wird normalerweise durch Illumina Sequenzierungsansätze bearbeitet. Je nach Fragestellung gibt es dabei Variationen und Adaptionen in der Vorbereitung der Sequenzierbibliothek oder es werden im Vorlauf chemische Behandlung an der RNA vorgenommen. Im Gegensatz dazu haben wir das Potenzial der nativen RNA Sequenzierung evaluiert, gleichzeitig verschiedene transkriptionelle Merkmale in einem Bakterium (Escherichia coli) und in Archaeen (Haloferax volcanii, P. furiosus) zu adressieren. Durch die Analyse von Meta- und Einzelmoleküldaten waren wir in der Lage lange Transkriptionseinheiten neu zu annotieren und Transkriptgrenzen akkurat zu definieren. Außerdem konnten wir zeigen, dass lange Sequenzierstücke ein wertvolles Werkzeug für die Erkennung heterogener Terminationsstellen sind und dass in Archaeen verschiedene Termiationsmechanismen auftreten. Insbesondere haben wir das Einzelmolekül-Potenzial dazu genutzt, um durch die Beschreibung zusätzlicher Intermediate den bisher nur unzureichend verstandenen Reifungsprozess der ribosomalen RNA in Archaeen nachzuvollziehen. Darüber hinaus waren wir in der Lage, RNA-Basenmodifikationen in Form systematischer Basecalling- Fehler und Verschiebungen im aufgezeichneten Profil des Ionenstroms nachzuweisen, wodurch wir die relative zeitliche Abfolge der KsgA-abhängigen Dimethylierung und N4- Acetylierung in reifer und Vorläufer-16S-rRNA nachverfolgen konnten. Als drittes Projekt, wurde das neue Referenzgenom als Grundlage dafür genutzt, um in einem integrativen RNA-seq- und ChIP-seq-basierten Ansatz die Funktion des Transkriptionsregulators CopR während der Kupferentgiftung in P. furiosus zu entschlüsseln. Um einen globalen Überblick über die transkriptomische Reaktion zu erhalten und Komponenten des CopR-Regulons zu identifizieren, führten wir nach Kupferschock eine differentielle Genexpressionsanalyse und eine ChIP-seq-Analyse durch. Wir haben festgestellt, dass CopR, das für die Kupferentgiftung essentiell ist, an die stromaufwärts gelegenen Regionen stark kupferinduzierter Gene bindet, die alle durch ein gemeinsames palindromisches Motiv gekennzeichnet sind. Zusätzlich zeigte die Transmissionselektronenmikroskopie von negativ-gefärbten Präparaten und anschließende Bildanalyse durch Mittelung der 2D-Klassen, dass CopR, ähnlich wie andere Faktoren der Lrp-Familie, in einer oktameren Konformation an die DNA bindet. Basierend auf den Ergebnissen schlugen wir ein Modell für die allosterische Regulation von CopR nach Kupferbindung vor und beschrieben die verschiedenen Stadien der Kupferentgiftung bei P. furiosus.
Die Ergebnisse der Manuskripte, aus denen diese Arbeit besteht, tragen zu einem tieferen Verständnis der grundlegenden und regulatorischen Prinzipien der Transkription in Archaeen bei und liefern zudem ein Update der genomischen und transkriptomischen Landschaft von P. furiosus. Außerdem stellt die Anwendung der auf Nanoporen basierenden nativen RNA-Sequenzierung nicht nur eine bedeutende Erweiterung des Methodenspektrums für das Transkriptionsfeld dar, sondern lieferte uns auch eine Fülle von Informationen, insbesondere zu transkriptionellen und posttranskriptionellen Ereignissen während der rRNA-Reifung.
Metadaten zuletzt geändert: 04 Aug 2021 07:05
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik