In dieser Arbeit wurde eine allgemeine Methodik entwickelt, mit der es möglich ist, humane Proteine Fluoreszenzspektroskopisch in FRET-basierten Messungen auf Einzelmolekülebene zu betrachten. Dabei werden die Proteine in humanen Zelllinien exprimiert, wodurch sie in einer möglichst nativen Form gewonnen werden. Darüber hinaus ist es durch die Verwendung der Amber-Supressionsstrategie möglich, ...
Zusammenfassung (Deutsch)
In dieser Arbeit wurde eine allgemeine Methodik entwickelt, mit der es möglich ist, humane Proteine Fluoreszenzspektroskopisch in FRET-basierten Messungen auf Einzelmolekülebene zu betrachten. Dabei werden die Proteine in humanen Zelllinien exprimiert, wodurch sie in einer möglichst nativen Form gewonnen werden. Darüber hinaus ist es durch die Verwendung der Amber-Supressionsstrategie möglich, das Protein an jeglicher Position mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu versehen. Dadurch können Positionen vermieden werden, die beispielsweise formgebend sind oder für die Aktivität des Proteins verantwortlich sind. Da die Markierung über eine einzige unnatürliche Aminosäure vermittelt wird, die in das zu untersuchende Protein inkorporiert wird, handelt es sich um nur einen minimalen Eingriff in die Proteinstruktur, der bei richtiger Positionierung keine Auswirkung auf die Aktivität des Proteins hat (3.2.2.2). Durch die in dieser Arbeit verwendete unnatürlichen Aminosäure AzF, kann das Protein über dessen Azid-Gruppe spezifisch mit einem organischen Fluoreszenz-Farbstoff markiert werden (3.2.3 und 3.3). Organische Farbstoffe weisen oft hohe Quantenausbeuten auf, sodass mit ihnen quantitative fluoreszenzbasierte Messungen möglich sind, wie beispielsweise FRET-Messungen auf Einzelmolekülebene. In Verbindung mit dem Einzelmolekül-Pulldown (SiMPull) war es möglich, diese Proteine spezifisch auf Oberflächen zu immobilisieren, die sich für Einzelmolekül-spektroskopische Messungen eignen. Dies schließt auch Protein-Protein und Protein-RNA Komplexe (3.1.3) ein, die für die Untersuchung auf Einzelmolekülebene zugänglich gemacht wurden.
So war es möglich mit Hilfe des SiMPulls einen Pre-RISC aus hAgo und hDicer1 auf Einzelmolekülebene nachzuweisen. Zudem konnte die Interaktion zwischen hAgo2 und Guide-RNAs als auch Target-RNAs auf Einzelmolekülebene nachgewiesen werden. Durch die Kombination aus SiMPull und der Amber-Supressionsstrategie konnten darüber hinaus erstmals FRET-Messungen mit markiertem hAgo2 durchgeführt werden und die Auswirkungen von verschiedenen gebunden RNA-Molekülen (3.2.4.4, 3.2.4.6 und 3.2.4.7) und der Hyper-Phosphorylierung des C-terminalen Phosphat-Clusters auf die Struktur von hAgo2 (3.2.5) untersucht werden. Durch die Einzelmolekül-FRET-Messung war es dabei möglich den Zustand der einzelnen Moleküle zu beobachten, wodurch unterschiedliche Populationen in der Probe ausgemacht werden konnten und es konnte gezeigt werden, dass der Komplex aus hAgo2 und Guide-RNA zwei unterschiedliche Konformationen annimmt. Liegt hAgo2 allerdings in seiner hyper-phosphorylierten Form (hAgo2F23AzF-824:34E) vor, konnte ein signifikanter Unterschied in der Molekül-Verteilung ausgemacht werden, da der Low-FRET Zustand bevorzugt von dem Komplex eingenommen wurde, was darauf hindeutet, dass es Unterschiede bei der Beladung mit einer miRNA und der Beladung mit einer mRNA gibt.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In this work a general methodology was developed with which it is possible to observe human proteins fluorescence spectroscopically in FRET-based measurements on the single molecule level. The proteins are expressed in human cell lines, which means that they are obtained in a form that is as native as possible. In addition, by using the amber suppression strategy, it is possible to provide the ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In this work a general methodology was developed with which it is possible to observe human proteins fluorescence spectroscopically in FRET-based measurements on the single molecule level. The proteins are expressed in human cell lines, which means that they are obtained in a form that is as native as possible. In addition, by using the amber suppression strategy, it is possible to provide the protein with a fluorescent dye at any position. In this way, positions can be avoided that are, for example, shaping or responsible for the activity of the protein. Since the labeling is mediated by a single unnatural amino acid that is incorporated into the protein to be examined, there is only a minimal intervention in the protein structure which, if correctly positioned, has no effect on the activity of the protein (3.2.2.2). Due to the unnatural amino acid AzF used in this work, the protein can be specifically labeled with an organic fluorescent dye via its azide group (3.2.3 and 3.3). Organic dyes often have high quantum yields, so that quantitative fluorescence-based measurements are possible with them, such as FRET measurements at the single molecule level. In connection with the single-molecule pulldown (SiMPull) it was possible to specifically immobilize these proteins on surfaces that are suitable for single-molecule spectroscopic measurements. This also includes protein-protein and protein-RNA complexes (3.1.3), which have been made available for investigation at the single-molecule level.
With the help of the SiMPull it was possible to detect a pre-RISC of hAgo and hDicer1 on the single molecule level. In addition, the interaction between hAgo2 and guide RNAs as well as target RNAs could be demonstrated on the single molecule level. Through the combination of SiMPull and the amber suppression strategy, FRET measurements with labeled hAgo2 could be carried out for the first time and the effects of various bound RNA molecules (3.2.4.4, 3.2.4.6 and 3.2.4.7) and the hyper-phosphorylation of the C-terminal phosphate clusters can be examined for the structure of hAgo2 (3.2.5). The single-molecule FRET measurement made it possible to observe the state of the individual molecules, which made it possible to identify different populations in the sample and it was possible to show that the complex of hAgo2 and guide RNA adopts two different conformations. However, if hAgo2 is in its hyper-phosphorylated form (hAgo2F23AzF-824:34E), a significant difference in the molecule distribution could be made out, since the low-FRET state was preferentially occupied by the complex, which suggests that there are differences when loaded with a miRNA and when loaded with a mRNA.
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