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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-510680
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.51068
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 25 November 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Date of exam: | 26 November 2021 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie > Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Keywords: | Ciliogenesis; Correlative light and electron microscopy; STEM tomography |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 51068 |
Abstract (English)
The primary cilium – a “microtubule-based organelle” (Mirvis et al. 2018) originating from a basal body – fulfills a variety of sensory functions in “most mammalian cell types” (Satir et al. 2010) (Anderson et al. 2008; Breslow & Holland 2019; Pedersen et al. 2012; Witzgall 2018a). Its formation is a complex, “multistep process” (Pitaval et al. 2017). The small GTPase RAB8 is an important ...
Abstract (English)
The primary cilium – a “microtubule-based organelle” (Mirvis et al. 2018) originating from a basal body – fulfills a variety of sensory functions in “most mammalian cell types” (Satir et al. 2010) (Anderson et al. 2008; Breslow & Holland 2019; Pedersen et al. 2012; Witzgall 2018a). Its formation is a complex, “multistep process” (Pitaval et al. 2017). The small GTPase RAB8 is an important molecular player for ciliogenesis in cell culture as it contributes to the extension of the ciliary vesicle at the distal end of the basal body, a process known as prerequisite for axoneme outgrowth (Lu et al. 2015; Nachury et al. 2007). However, studies investigating centrosomal RAB8 recruitment in combination with the three-dimensional visualization of membrane remodeling processes at this period of ciliogenesis are rare to date. Correlative light and electron microscopy (CLEM) techniques provide options to achieve this.
We adapted two CLEM techniques to assign “fluorescently tagged proteins […] to their ultrastructural compartments” (Buerger et al. 2021). First, we extended the Kukulski protocol (Kukulski et al. 2011, 2012) and combined it with 200 kV bright-field scanning transmission electron (STEM) tomography with an electron beam with low semi-convergence angle (Rachel et al. 2020). Thereby it was possible to identify cellular structures such as mature primary cilia but also multivesicular bodies and to three-dimensionally visualize almost their entire ultrastructure in single tomograms. However, resin embedding prior to fluorescence microscopy resulted in loss of fluorescence intensity which made it impossible to preserve weak fluorescence signals of fluorescent proteins at the onset of cilia formation. For investigating centrosomal RAB8 recruitment, fluorescence microscopy was performed before sample preparation for electron microscopy. Retinal pigment epithelial (RPE1) cells showing the earliest moment detectable by fluorescence microscopy with RAB8A localizing to the centriole of a developing cilium were selected. Subsequent STEM tomography revealed a donut-like membrane structure formation during ciliogenesis which, according to our knowledge, has not been described so far: vesicles docked to the distal appendages of the basal body primarily fuse with incoming vesicles via a laterally directed process to form a donut-like structure. The central hole of this structure is closed afterwards to form the large so-called ciliary vesicle. Vesicles within the lumen of the microtubule barrel of the basal body are not enriched during these ciliogenetic processes. In contrast, fusion/budding events were observed at the distal part of docked membrane structures. RAB8A-positive membrane structures docked to the distal appendages of the basal body were present starting with the donut-like stadium of ciliogenesis. This suggests a role of RAB8A during the extension of the ciliary vesicle. By overexpressing dominant-negative mutants of RAB proteins in RPE1 cells we confirmed a role of the recycling endosome during ciliogenesis but could not unambiguously reproduce its contribution to centrosomal RAB8A recruitment. Early and late endosomes are dispensable for ciliogenesis in general.
The formation of primary cilia requires incoming membrane material and a variety of proteins (Witzgall 2018b). According to the prevailing opinion, a diffusion barrier has to be passed to enter the “ciliary compartment” (Hu & Nelson 2011) (Garcia-Gonzalo & Reiter 2012; Nachury et al. 2010; Pedersen et al. 2012; Rohatgi & Snell 2010). Nature and localization of this barrier is largely obscure to date. By visualizing the ciliary membrane on an ultrastructural level, a more detailed knowledge regarding the dimension of the “ciliary compartment” (Hu & Nelson 2011) should be generated.
A fusion protein of the M2 (Incardona et al. 2002; Xie et al. 1998) mutant of murine Smoothened (SmoM2) with horseradish peroxidase (HRP) and EGFP was stably expressed in Lilly Laboratories cell porcine kidney 1 (LLC-PK1) cells (Miyamoto et al. 2019) as marker for the ciliary membrane (Corbit et al. 2005); reviewed in (Hoffmeister et al. 2011). Via an HRP induced histochemical reaction (Connolly et al. 1994; Graham & Karnovsky 1966; reviewed in Witzgall 2018b) the HRP-SmoM2-EGFP fusion protein was visualized by transmission electron microscopy. Electron micrographs revealed a localization of HRP-SmoM2-EGFP not only at the membrane enclosing the ciliary axoneme but also at the membrane surrounding the base of primary cilia which is referred to as periciliary membrane in literature (Garcia et al. 2018; Garcia-Gonzalo & Reiter 2012; Long & Huang 2019; Pedersen et al. 2016). Therefore results of our work provide a hint that the composition of the membrane compartment at the ciliary base is more related to the ciliary membrane than to the plasma membrane.
Translation of the abstract (German)
Das primäre Zilium – ein „microtubule-based organelle“ (Mirvis et al. 2018), welches aus einem Basalkörper entspringt – erfüllt in „most mammalian cell types“ (Satir et al. 2010) eine Vielzahl von sensorischen Funktionen (Anderson et al. 2008; Breslow & Holland 2019; Pedersen et al. 2012; Witzgall 2018a). Seine Bildung ist ein komplexer „multistep process“ (Pitaval et al. 2017). Die kleine GTPase ...
Translation of the abstract (German)
Das primäre Zilium – ein „microtubule-based organelle“ (Mirvis et al. 2018), welches aus einem Basalkörper entspringt – erfüllt in „most mammalian cell types“ (Satir et al. 2010) eine Vielzahl von sensorischen Funktionen (Anderson et al. 2008; Breslow & Holland 2019; Pedersen et al. 2012; Witzgall 2018a). Seine Bildung ist ein komplexer „multistep process“ (Pitaval et al. 2017). Die kleine GTPase RAB8 ist ein wichtiger molekularer Akteur bei Ziliogenese in Zellkultur, da sie zur Extension des Ziliarvesikels am distalen Ende des Basalkörpers beiträgt, ein Prozess, der Voraussetzung für das Axonemwachstum ist (Lu et al. 2015; Nachury et al. 2007). Studien, welche die zentrosomale RAB8-Rekrutierung in Kombination mit 3D-Visualisierung von Membranumbauprozessen in dieser Phase der Ziliogenese untersuchen, sind bisher selten. Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) bietet Möglichkeiten, dies zu erreichen. Wir passten zwei CLEM-Techniken an, um „fluorescently tagged proteins […] to their ultrastructural compartments“ zuzuordnen (Buerger et al. 2021). Zunächst erweiterten wir das Kukulski-Protokoll (Kukulski et al. 2011, 2012) und kombinierten es mit 200 kV Hellfeld- Rastertransmissionselektronen (STEM)-Tomographie mit einem Elektronenstrahl mit kleinem Semikonvergenzwinkel (Rachel et al. 2020). Dies ermöglichte zelluläre Strukturen wie ausgewachsene primäre Zilien aber auch multivesikuläre Körperchen zu identifizieren und nahezu deren gesamte Ultrastruktur in einzelnen Tomogrammen in 3D darzustellen. Die Harzeinbettung vor der Fluoreszenzmikroskopie (FM) führte jedoch zu einem Verlust an Fluoreszenzintensität, weshalb schwache Signale fluoreszierender Proteine zu Beginn der Ziliogenese nicht erhalten werden konnten. Zur Untersuchung der zentrosomalen RAB8-Rekrutierung wurde vor Probenpräparation für EM FM durchgeführt. Retinale Pigmentepithelzellen (RPE1), die den frühesten mittels FM detektierbaren Zeitpunkt zeigen, zu welchem RAB8A an die Zentriole eines sich entwickelnden Ziliums lokalisiert, wurden ausgewählt. Die anschließende STEM-Tomographie zeigte eine nach unserem Kenntnisstand bisher nicht beschriebene Donut-ähnliche Membranstrukturbildung während der Ziliogenese: an distale Anhängsel des Basalkörpers gedockte Vesikel fusionieren zuerst lateral mit ankommenden Vesikeln zu einer Donut-ähnlichen Struktur. Das zentrale Loch dieser Struktur wird anschließend verschlossen, um das große sog. Ziliarvesikel zu bilden. Eine Anreicherung von Vesikeln innerhalb des Lumens des Achsenzylinders des Basalkörpers findet während dieser ziliogenetischen Prozesse nicht statt. Im Gegensatz dazu wurden im distalen Bereich der gedockten Membranstrukturen Fusions-/Knospungsereignisse beobachtet. RAB8A-positive Membranstrukturen, welche an die distalen Anhängsel des Basalkörpers gedockt waren, waren vom Donut-ähnlichen Stadium der Ziliogenese an vorhanden. Dies deutet auf eine Rolle von RAB8A bei der Extension des Ziliarvesikels hin. Mittels Überexpression dominant-negativer Mutanten von RAB-Proteinen in RPE1-Zellen bestätigten wir eine Rolle des Recycling-Endosoms während der Ziliogenese, konnten jedoch dessen Beitrag zur zentrosomalen RAB8A-Rekrutierung nicht eindeutig reproduzieren. Frühe und späte Endosomen sind für die Ziliogenese generell entbehrlich. Die Bildung von primären Zilien erfordert ankommende Membranen und eine Vielzahl von Proteinen (Witzgall 2018b). Um in das „ciliary compartment“ (Hu & Nelson 2011) zu gelangen, muss nach vorherrschender Meinung eine Diffusionsbarriere passiert werden (Garcia-Gonzalo & Reiter 2012; Nachury et al. 2010; Pedersen et al. 2012; Rohatgi & Snell 2010). Beschaffenheit und Lokalisation dieser Barriere sind bis heute weitestgehend unbekannt. Durch die Visualisierung der Ziliarmembran auf ultrastruktureller Ebene soll ein detaillierteres Wissen über die Dimension des „ciliary compartment“ (Hu & Nelson 2011) generiert werden. Ein Fusionsprotein der M2 (Incardona et al. 2002; Xie et al. 1998) Mutante von murinem Smoothened (SmoM2) mit Meerrettichperoxidase (HRP) und EGFP wurde stabil in Lilly Laboratories cell porcine reniere 1 (LLC-PK1) Zellen (Miyamoto et al. 2019) als Marker für die Ziliarmembran exprimiert (Corbit et al. 2005); rezensiert in (Hoffmeister et al. 2011). Mittels HRP-induzierter histochemischer Reaktion (Connolly et al. 1994; Graham & Karnovsky 1966; rezensiert in Witzgall 2018b) wurde HRP-SmoM2-EGFP mit Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht. EM-Aufnahmen zeigten eine Lokalisation von HRP-SmoM2-EGFP nicht nur an der Membran, die das Axonem umgibt, sondern auch an der Membran, die die Basis primärer Zilien umgibt, in der Literatur als Periziliarmembran bezeichnet (Garcia et al. 2018; Garcia-Gonzalo & Reiter 2012; Long & Huang 2019; Pedersen et al. 2016). Daher liefern die Ergebnisse unserer Arbeit einen Hinweis darauf, dass die Zusammensetzung des Membrankompartiments an der Ziliarbasis eher der Ziliarmembran als der Plasmamembran entspricht.
Metadata last modified: 25 Nov 2022 05:43
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