| License: Creative Commons Attribution 4.0 (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-523268
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.52326
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 7 June 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Dr. Ekkehard Haen |
| Date of exam: | 20 May 2022 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmacology and Toxicology (Prof. Schlossmann, formerly Prof. Seifert) |
| Keywords: | Asymmetrisches Dimethylarginin, ADMA, HPLC, SPE, Abdampfen, Schizophrenie, Depression, Bipolare Störung, Schizoaffektive Störung, Asymmetric dimethylarginine, Evaporation, Schizophrenia, Bipolar disorder, Schizoaffektive disorder |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 52326 |
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde eine HPLC-Methode mit einer zeitsparenden Probenvorbereitung zur quantitativen Erfassung von ADMA in humanem Serum entwickelt. Die Festphasenextraktion wird an dem starken Kationenaustauschpolymer Oasis® MCX (Waters) unter Verwendung eines Elutionsmittels bestehend aus 0,4g Kaliumchlorid, 5,96ml Wasser, 0,04ml 5M Kaliumhydroxid-Lösung und 4ml Methanol durchgeführt. Dazu ...
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde eine HPLC-Methode mit einer zeitsparenden Probenvorbereitung zur quantitativen Erfassung von ADMA in humanem Serum entwickelt. Die Festphasenextraktion wird an dem starken Kationenaustauschpolymer Oasis® MCX (Waters) unter Verwendung eines Elutionsmittels bestehend aus 0,4g Kaliumchlorid, 5,96ml Wasser, 0,04ml 5M Kaliumhydroxid-Lösung und 4ml Methanol durchgeführt. Dazu werden die SPE-Säulen zunächst mit dem Elutionsmittel präkonditioniert und anschließend mit Wasser equilibriert. Eine zu analysierende Serumprobe wird mit dem internen Standard MEA und Wasser versetzt, bevor die SPE-Säulen damit beladen werden. Nachdem die Säulen mit 0,1M Salzsäure und Methanol gewaschen wurden, erfolgt die Elution mit dem entwickelten Elutionsmittel. Anschließend wird mit OPA und MPA derivatisiert. Für die HPLC-Analytik wird die Säule Kinetex® EVO C18 2,6µm 150x4,6 100A (Phenomenex) geschützt durch die Vorsäule SecurityGuard® Ultra cartridge for EVO-C18 (Phenomenex) verwendet. Als Fließmittel wird ein Kaliumphosphatpuffer 25mM pH6,5, welcher 9,7% Acetonitril (V/V) enthält, eingesetzt. Es werden 5µl der derivatisierten Probe injiziert und bei einem Flow von 1ml/min und einer Säulenofentemperatur von 40°C 13min isokratisch getrennt. Die Detektion erfolgt fluorimetrisch. Vor der nächsten Injektion wird die Säule gewaschen und equilibriert. Die externen Standards werden in gleicher Weise aufbereitet und analysiert wie die Serumproben. Bei der Zusammensetzung des Elutionsmittels für die SPE wurde Ammoniak durch Kaliumhydroxid-Lösung und Kaliumchlorid ersetzt. Da das Elutionsmittel somit keine Bestandteile enthält, welche die Derivatisierung und HPLC-Analytik stören, ist ein Abdampfen nach dem SPE-Verfahren nicht notwendig, sodass Zeit, Energie und Kosten eingespart werden können.
Es wurden Extraktionsausbeuten von 93,4% für ADMA und 92,8% für MEA und damit eine relative Extraktionsausbeute von 101% ermittelt. Das Bestimmtheitsmaß der Regressionsgeraden zur Ermittlung der Linearität im Bereich von 25ng/ml (LOQ) bis 800ng/ml beträgt R² = 0,9999. Der Bias beträgt 12,0% am LOQ und 5,61% bei einer Konzentration von 50ng/ml. Bei allen höheren Konzentrationen liegt er unter 3,0%. Die Ermittlung der Präzision ergab CVintra-assay = 2,1% und CVinter-assay = 3,1% für niedrige ADMA-Konzentration und CVintra-assay = 1,9% und CVinter-assay = 2,8% für hohe ADMA-Konzentrationen. Der Matrixeffekt ist mit einem Bestimmtheitsmaß der Regressionsgeraden von R2Matrix = 0,9978 vernachlässigbar. Die Methode erfüllt alle gestellten Anforderungen an Extraktionsausbeute, Linearität, Richtigkeit, Präzision und Matrixeffekt. Durch ihre Anwendung lässt sich zuverlässig die ADMA-Konzentration im Serum ermitteln. Somit ist die entwickelte Methode valide.
Unter Verwendung dieser Methode wurde im Serum gesunder Personen eine mittlere ADMA-Konzentration von 84.8 ± 11.9 ng/ml = 0.419 ± 0.059 µM (n=16) gemessen. Obwohl sich die bisher publizierten ADMA-Konzentrationen bei Gesunden teilweise stark unterscheiden, kamen einige frühere Studien zu einem dieser Arbeit sehr ähnlichen Ergebnis. Da verschiedene analytische Methoden zu unterschiedlichen Ergebnissen führen können, sollten Vergleiche der ADMA-Konzentrationen immer mit derselben Methode durchgeführt werden.
Die mit der entwickelten Methode gemessenen Serumkonzentrationen von ADMA sind bei Patient/-innen mit psychiatrischen Erkrankungen im Vergleich zu gesunden Personen signifikant erhöht. ADMA ist somit vermutlich an der Pathophysiologie psychiatrischer Erkrankungen beteiligt.
Sowohl bei den Gesunden als auch bei den psychisch Erkrankten existiert keine Korrelation zwischen der ADMA-Konzentration und dem Personenalter. Die Serumkonzentration von ADMA nimmt mit höherem Probandenalter nicht zu.
Bei der Kontrollgruppe sowie bei Patient/-innen mit psychiatrischen Erkrankungen sind keine signifikanten Unterschiede zwischen Frauen und Männern in den ADMA-Konzentrationen feststellbar. ADMA ist vermutlich gleichermaßen bei Frauen und Männern an der Pathophysiologie dieser Erkrankungen beteiligt
Die ADMA-Konzentrationen von Patient/-innen mit verschiedenen Schweregraden einer psychiatrischen Erkrankung unterscheiden sich nicht signifikant voneinander. Somit ist die Quantifizierung von ADMA vermutlich nicht für das Therapie-Monitoring psychiatrischer Erkrankungen geeignet.
Es sind keine signifikanten Unterschiede zwischen Patient/-innen, die sich während der Therapie verbesserten, und Patient/-innen, die sich während der Therapie nicht verbesserten, feststellbar. Auch aus diesem Grund eignet sich ADMA vermutlich nicht, um den Therapieverlauf einer psychischen Erkrankung zu überwachen.
Die ADMA-Konzentrationen verschiedener Gruppen unterteilt nach Wirkstoff, dessen Serumkonzentration mindestens 50% der unteren Grenze des Therapeutischen Referenzbereiches betrug, unterscheiden sich nicht signifikant voneinander. Somit ist kein Einfluss der Medikation auf die ADMA-Werte erkennbar.
Die ADMA-Konzentrationen sind jeweils bei Patient/-innen mit Schizophrenie, Depression, Bipolarer Störung und Schizoaffektiver Störung im Vergleich zu gesunden Personen signifikant erhöht. Aus dieser Tatsache können sich neue Ansatzpunkte für Diagnostik und Therapie der genannten psychiatrischen Erkrankungen ergeben. Die ADMA-Konzentrationen dieser Patientengruppen unterscheiden sich dabei nicht signifikant voneinander.
Die Serumkonzentrationen von ADMA sind bei Personen mit rezidivierender depressiver Störung im Vergleich zu Personen mit einer depressiven Episode signifikant erhöht, was vermutlich durch stärkere pathologische Veränderungen im ADMA-NOS-System bei längerem Krankheitsverlauf bedingt ist.
Es existieren keine signifikanten Unterschiede in den Serumkonzentrationen von ADMA zwischen Patient/-innen, die sich in einer manischen, einer depressiven oder einer gemischten Episode einer schizoaffektiven oder bipolaren Störung befinden. Somit ist ADMA vermutlich in ähnlicher Weise an der Pathophysiologie aller dieser Zustände beteiligt.
Die ADMA-Konzentrationen psychisch Erkrankter unterscheiden sich nicht signifikant von den ADMA-Konzentrationen psychisch und gleichzeitig kardiovaskulär Erkrankter. Die Erhöhung der ADMA-Konzentration kann die gemeinsame Ursache beider Erkrankungen sein.
Translation of the abstract (English)
An HPLC method with a time-saving sample preparation was developed for the quantitative detection of ADMA in human serum. Solid phase extraction (SPE) is performed on the strong cation exchange polymer Oasis® MCX (Waters) using an eluent consisting of 0.4g potassium chloride, 5.96ml water, 0.04ml 5M potassium hydroxide solution and 4ml methanol. SPE columns are first preconditioned with the ...
Translation of the abstract (English)
An HPLC method with a time-saving sample preparation was developed for the quantitative detection of ADMA in human serum. Solid phase extraction (SPE) is performed on the strong cation exchange polymer Oasis® MCX (Waters) using an eluent consisting of 0.4g potassium chloride, 5.96ml water, 0.04ml 5M potassium hydroxide solution and 4ml methanol. SPE columns are first preconditioned with the eluent and then equilibrated with water. A serum sample to be analyzed is mixed with the internal standard monoethylarginine and water before loading the SPE columns with it. After the columns are washed with 0.1M hydrochloric acid and methanol, elution is performed with the developed eluent. Subsequently, derivatization is carried out with o-phthaldialdehyde and 3-mercaptopropionic acid. For HPLC analysis, the column Kinetex® EVO C18 2.6µm 150x4.6 100A (Phenomenex) protected by the precolumn SecurityGuard® Ultra cartridge for EVO-C18 (Phenomenex) is used. A potassium phosphate buffer 25mM pH6.5 containing 9.7% acetonitrile (V/V) is used as the eluent. 5µl of the derivatized sample is injected and isocratically separated at a flow of 1ml/min and a column oven temperature of 40°C for 13min. Detection is performed fluorimetrically. The column is washed and equilibrated before the next injection. The external standards are prepared and analyzed in the same way as the serum samples. In the composition of the eluent for the SPE, ammonia was replaced by potassium hydroxide solution and potassium chloride. Since the eluent thus contains no components that interfere with derivatization and HPLC analysis, evaporation after the SPE procedure is not necessary, thus saving time, energy and costs.
Extraction yields of 93.4% for ADMA and 92.8% for MEA were determined, resulting in a relative extraction yield of 101%. The coefficient of determination of the regression line to determine linearity in the range of 25ng/ml (LOQ) to 800ng/ml is R² = 0.9999. The bias is 12.0% at LOQ and 5.61% at a concentration of 50ng/ml. At all higher concentrations it is less than 3.0%. Determination of precision gave CVintra-assay = 2.1% and CVinter-assay = 3.1% for low ADMA concentration and CVintra-assay = 1.9% and CVinter-assay = 2.8% for high ADMA concentrations. The matrix effect is negligible with a coefficient of determination of the regression line of R2matrix = 0.9978. The method meets all the requirements set for extraction yield, linearity, accuracy, precision and matrix effect. Its application allows reliable determination of ADMA concentration in serum. Thus, the developed method is validated.
Using this method, a mean ADMA concentration of 84.8 ± 11.9 ng/ml = 0.419 ± 0.059 µM (n=16) was measured in the serum of healthy individuals. Although previously published ADMA concentrations in healthy individuals vary widely, several earlier studies reached a result very similar to this work. Since different analytical methods may lead to different results, comparisons of ADMA concentrations should always be performed using the same method.
Serum concentrations of ADMA measured by the developed method are significantly elevated in patients with psychiatric disorders compared to healthy individuals. ADMA may be involved in the pathophysiology of psychiatric disorders.
There is no correlation between ADMA concentration and subject age in both healthy and mentally ill subjects. The serum concentration of ADMA does not elevate with higher subject age.
In the control group and in patients with psychiatric disorders, no significant differences between women and men in ADMA concentrations are detectable. ADMA is probably equally involved in the pathophysiology of these diseases in women and men.
ADMA concentrations of patients with different severities of psychiatric illness are not significantly different from each other. Thus, quantification of ADMA is presumably not suitable for therapy monitoring of psychiatric disorders.
There are no significant differences between patients who improved during therapy and patients who did not improve during therapy. For this reason, too, ADMA is probably not suitable for monitoring the therapy of a mental illness.
The ADMA concentrations of different groups subdivided by drug whose serum concentration was at least 50% of the lower limit of the therapeutic reference range did not differ significantly from each other. Thus, no influence of medication on ADMA levels is identifiable.
ADMA concentrations are significantly elevated in patients with schizophrenia, depression, bipolar disorder and schizoaffective disorder compared to healthy individuals. This fact may provide new starting points for diagnostics and therapy of psychiatric disorders. The ADMA concentrations of these patient groups do not differ significantly from each other.
Serum concentrations of ADMA are significantly elevated in individuals with recurrent depressive disorder compared with individuals with one depressive episode, presumably due to greater pathological changes in the ADMA-NOS system with prolonged illness.
No significant differences in serum concentrations of ADMA exist between patients who are in a manic episode, a depressive episode, or a mixed episode of schizoaffective or bipolar disorder. Thus, ADMA is probably similarly involved in the pathophysiology of these conditions.
The ADMA concentrations of mentally ill patients are not significantly different from the ADMA concentrations of mentally and simultaneously cardiovascularly ill patients. The increase in ADMA concentration may be the cause of both diseases.
Metadata last modified: 07 Jun 2022 13:03
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