Reconstitution of the RNA polymerase I initiation complex from recombinant initiation factors and regulation of its activity

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-526494
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.52649

Pilsl, Michael

Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand
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(12MB)

Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 18 Dez 2023 07:59

Details

Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	18 Dezember 2022
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Herbert Tschochner und Prof. Dr. Klaus Grasser
Tag der Prüfung:	17 Dezember 2021
Institutionen:	Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > House of the Ribosome Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Herbert Tschochner
Stichwörter / Keywords:	Pol I; Transcription; RNA Pol I;
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	52649

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Zusammenfassung (Englisch)

Zusammenfassung (Englisch)

In fast growing cells, up to 60% of total transcription is devoted to ribosomal RNA synthesis. In eukaryotes a specialized enzyme, RNA polymerase I (Pol I), synthesizes a polycistronic precursor rRNA which is the 35S ribosomal RNA (rRNA) in the yeast S. cerevisiae. Whereas Pol II and Pol III use similar mechanisms to initiate transcription, the processes underlying Pol I promoter recognition, initiation complex formation and DNA melting substantially diverge. The transcription initiation factor CF (core factor) together with Pol I and the Pol I-bound initiation factor Rrn3 initiates in vitro transcription at a basal level. Binding of Upstream-Activating-Factor (UAF) and TATA-Binding-Protein (TBP) to the upstream promoter element (UE) enhance Pol I transcription initiation in vitro and are essential for Pol I-dependent rRNA synthesis in vivo. I reconstituted Pol I transcription initiation from highly purified factors to understand molecular mechanisms underlying this process. I combined biochemical characterisation of Pol I and its transcription factors with electron cryo microscopy (cryo EM). We obtained a cryo EM density of a highly active Pol I/Rrn3 complex at 7,5 Å and compared it with monomeric and dimeric Pol I. Rrn3 binds at the Pol I stalk and contacts subunits AC40 and A190. Rrn3 binding occludes A43-connector association and thereby prevents dimerization. Rrn3-bound and monomeric Pol I differ from the dimeric enzyme in cleft opening, and localization of the A12.2 C-terminus in the active center. Rrn3 stabilizes monomeric Pol I and drives pre-initiation complex formation (PIC). I used a fully reconstituted transcription system to better define contributions of individual PIC components to highly efficient Pol I initiation. My results suggested that UAF recruits TBP to the promoter, UAF and TBP stabilize CF and form a stable ‘committed’ complex. Net1-C might be associated with this complex, and acts as an activation domain which could be functionally conserved in mammalian UBF. Further, re-investigation of Pol I promoter elements allowed a more precise description of cis-acting elements and their interaction with Pol I transcription factors. Finally, we obtained a high-resolution cryo-EM reconstruction of a Pol I early initiation intermediate at 3,5 Å resolution. Our analysis showed, how efficient promoter-backbone interactions were achieved by re-arrangement of flexible regions in CF subunits Rrn7 and Rrn11. Destabilization of the melted DNA region correlated with a contraction of the polymerase cleft upon transcription activation, thereby combining promoter recruitment with DNA melting.

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

In schnell wachsenden Zellen beträgt der Anteil der ribosomalen RNA (rRNA) Synthese bis zu 60% der gesamten zellulären Transkription. In Eukaryoten synthetisiert ein spezialisiertes Enzym, RNA Polymerase (Pol I), einen polycistronischen rRNA Vorläufer. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist dies die 35S prä-rRNA. Während Pol II und Pol III ähnliche Mechanismen zur Transkriptionsinitiation nutzen, unterscheiden sich die zugrundeliegenden Prozesse der Promoter-Erkennung, der Assemblierung des Initiationskomplexes und des Aufschmelzens der doppelsträngigen DNA bei Pol I. Transkriptionsinitiationsfaktor ‚Core Factor‘ (CF) zusammen mit Pol I und dem Pol I assoziierten Faktor Rrn3 ermöglicht basale Transkriptionsinitiation in vitro. Bindung des ‚Upstream Activation Factor‘ (UAF) und TATA-Binding Protein (TBP) zum ‚Upstream Promoter Element‘ (UE) stimuliert Pol I abhängige Initiation in vitro und ist essentiell für Pol I abhängige rRNA Synthese in vivo.
Um die molekularen Mechanismen die diesem Prozess zu Grunde liegen zu verstehen, habe ich Pol I Transkriptionsinitiation aus hochreinen Komponenten rekonstituiert. Biochemische Charakterisierung von Pol I und den zugehörigen Transkriptionsfaktoren wurden mit struktureller Untersuchung mittels Elektronen-Kryo-Mikroskopie (cryo EM) kombiniert. Dadurch konnten wir eine cryo EM Dichte eines hochaktiven Pol I/Rrn3 Komplexes mit einer Auflösung von 7,5 Å bestimmen und verglichen diese mit monomerer und dimerer Pol I. Rrn3 bindet am Pol I ‚Stalk‘, außerdem wurden Interaktionen mit den Untereinheiten AC40 und A190 beobachtet. Die Assoziation von Rrn3 verhindert die Bindung des A43- ‚Connector‘ eines zweiten Enzyms und kann dadurch Pol I Dimerisierung verhindern. Das Rrn3 gebundene und das monomere Enzym unterscheiden sich vom Dimer in der Öffnung der ‚Cleft‘ und der Lokalisierung der C-terminalen Domäne von Untereinheit A12.2 im aktiven Zentrum. Dabei scheint Rrn3 den monomeren Zustand von Pol I zu stabilisieren und dadurch die Bildung des Initiationskomplexes zu fördern. Um die Beiträge der einzelnen Komponenten zur hoch effizienten Pol I Initiation besser zu definieren, wurde das vollständig rekonstituierte Transkriptionssystem verwendet. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass UAF TBP zum Promoter rekrutiert, zusammen können UAF und TBP wiederrum CF Bindung stabilisieren und einen robusten ‚Committed Complex‘ bilden. Net1-C kann mit diesem Komplex assoziiert sein und könnte als Aktivierungsdomäne wirken, welche im Faktor UBF in Säugetieren konserviert wäre. Weiterhin konnte durch eine Untersuchung der Pol I Promoter DNA, die dortigen cis-Elemente genauer beschrieben werden, sowie deren zusammen wirken mit den Pol I Transkriptionsfaktoren. Schließlich konnte eine hochauflösende cryo EM Struktur eines frühen Initiationszustandes auf 3,5 Å Auflösung bestimmt werden. Unsere Studie zeigt, wie effiziente Interaktionen mit dem DNA Rückgrat durch eine Re-Orientierung von flexiblen Bereichen in CF Untereinheiten Rrn7 und Rrn11 zustande kommen. Destabilisierung der aufgeschmolzenen DNA Region korreliert mit einer Kontraktion der ‚Cleft‘ der Polymerase während der Transkriptionsaktivierung, dabei wir die Rekrutierung an den Promoter und das aufschmelzen der DNA kombiniert.

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