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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-526888
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.52688
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 10 August 2022 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Gunter Meister |
| Tag der Prüfung: | 31 Mai 2022 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I > Prof. Dr. Gunter Meister |
| Stichwörter / Keywords: | Long non-coding RNA (lncRNA), Smooth Muscle Cell (SMC), Differentiation, Epigenetic, RNA modification, N6-methyladenosine |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Zum Teil |
| Dokumenten-ID: | 52688 |
Zusammenfassung (Englisch)
Smooth muscle cells (SMC) retain remarkable plasticity, which allows them to switch between a contractile differentiated and a proliferative de-differentiated phenotype in response to environmental cues. The alteration of this process constitutes a key factor in the development of cardiovascular diseases, highlighting the relevance of its study. A large body of evidence has shown that long ...
Zusammenfassung (Englisch)
Smooth muscle cells (SMC) retain remarkable plasticity, which allows them to switch between a contractile differentiated and a proliferative de-differentiated phenotype in response to environmental cues. The alteration of this process constitutes a key factor in the development of cardiovascular diseases, highlighting the relevance of its study. A large body of evidence has shown that long non-coding ribonucleic acids (lncRNAs) regulate a number of physiological and pathological processes, yet little is known about the role of these molecules in SMC biology. Furthermore, RNA modifications have emerged as a new layer of post-transcriptional regulation in recent years. In particular, it has been shown that N6-methyladenosine (m6A) participates in several fundamental biological processes, including cell fate decisions at different developmental stages. One of the main ways by which it regulates these processes is through the recognition of messenger RNAs (mRNAs) that contain this modification, by proteins that possess the YTH domain. In particular, the YTHDF2 reader has been implicated in the destabilization of modified RNAs, through the recruitment of the CCR4-NOT deadenylation complex. The objective of this thesis was to evaluate the participation of long non-coding RNAs in the phenotypic modulation of human SMC and to analyze the role of the m6A deposition, reading and removal machinery in this process. By the use of RNA deep sequencing, several regulated lncRNAs were identified during an in vitro model of human pulmonary artery SMC differentiation. The characterization of a specific candidate was carried out, and it was given the name "Differentiation And Growth Arrest related lncRNA" (DAGAR). A marked increase in DAGAR was observed during cell-to-cell contact-induced SMC differentiation which was shown to be necessary for this process. DAGAR expression decreased both during tumor necrosis factor (TNFα)-induced SMC dedifferentiation, and in total RNA isolated from pulmonary arteries of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) diagnosed patients compared to non-smoking controls. DAGAR silencing promoted a decrease in the expression of SMC markers, indicating defects in the conversion of these cells into a differentiated phenotype, which was concomitant with an increase in proliferation. Pull-down of DAGAR by the use of 3’ biotinylated DNA probes complementary to its sequence (raPOOLs, siTOOLs), followed by mass spectrophotometry, evidenced its interaction with proteins of the m6A methylation machinery. In correlation with these data, experiments of m6A immunoprecipitation (IP) from total RNA showed that DAGAR was m6A modified. Furthermore, DAGAR expression significantly increased after YTHDF2 silencing in both MRC5 lung fibroblasts and SMC. In addition, a marked decrease in not only YTHDF2, but also YTHDF1 and YTHDF3 was found during SMC differentiation. Immunoprecipitation of YTHDF2 followed by RNA deep sequencing (RIP-Seq) showed a specific enrichment of transcripts associated with SMC identity and biology, such as the smooth muscle myosin heavy chain (MYH11) and members of the TGFβ, PDGF and VEGF pathways, among others. Strikingly, YTHDF2 silencing in SMC promoted an increase in the expression of SMC specific markers. We conclude that SMC phenotype is regulated by the long non-coding RNA DAGAR and by the modulation of the m6A reader protein YTHDF2.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Glatte Muskelzellen (SMC) behalten eine bemerkenswerte Plastizität, die es ihnen ermöglicht, als Reaktion auf Umweltreize zwischen einem kontraktilen differenzierten und einem proliferativen dedifferenzierten Phänotyp zu wechseln. Die Veränderung dieses Prozesses stellt einen Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen dar, was die Relevanz seiner Studie unterstreicht. ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Glatte Muskelzellen (SMC) behalten eine bemerkenswerte Plastizität, die es ihnen ermöglicht, als Reaktion auf Umweltreize zwischen einem kontraktilen differenzierten und einem proliferativen dedifferenzierten Phänotyp zu wechseln. Die Veränderung dieses Prozesses stellt einen Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen dar, was die Relevanz seiner Studie unterstreicht. Eine große Menge an Beweisen hat gezeigt, dass lange nicht-kodierende Ribonukleinsäuren (lncRNAs) eine Reihe von physiologischen und pathologischen Prozessen regulieren, jedoch ist wenig über die Rolle dieser Moleküle in der SMC-Biologie bekannt. Darüber hinaus haben sich in den letzten Jahren RNA-Modifikationen als neue Ebene der posttranskriptionellen Regulation herausgebildet. Insbesondere wurde gezeigt, dass N6-Methyladenosin (m6A) an mehreren grundlegenden biologischen Prozessen beteiligt ist, einschließlich Entscheidungen über das Zellschicksal in verschiedenen Entwicklungsstadien. Einer der Hauptwege, auf dem es diese Prozesse reguliert, ist die Erkennung von Boten-RNAs (mRNAs), die diese Modifikation enthalten, durch Proteine, die die YTH-Domäne besitzen. Insbesondere der YTHDF2-Leser wurde durch die Rekrutierung des CCR4-NOT-Deadenylierungskomplexes mit der Destabilisierung modifizierter RNAs in Verbindung gebracht. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Beteiligung langer nicht-kodierender RNAs an der phänotypischen Modulation menschlicher SMC zu evaluieren und die Rolle der m6A-Ablagerungs-, -Lese- und -Entfernungsmaschinerie in diesem Prozess zu analysieren. Durch die Verwendung von RNA-Tiefensequenzierung wurden mehrere regulierte lncRNAs während eines In-vitro-Modells der SMC-Differenzierung der menschlichen Pulmonalarterie identifiziert. Die Charakterisierung eines bestimmten Kandidaten wurde durchgeführt und ihm der Name "Differentiation And Growth Arrest related lncRNA" (DAGAR) gegeben. Während der durch Zell-zu-Zell-Kontakt induzierten SMC-Differenzierung wurde ein deutlicher Anstieg von DAGAR beobachtet, was sich als notwendig für diesen Prozess herausstellte. Die DAGAR-Expression verringerte sich sowohl während der durch Tumornekrosefaktor (TNFα) induzierten SMC-Dedifferenzierung als auch in Gesamt-RNA, die aus Lungenarterien von Patienten mit diagnostizierter chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) isoliert wurde, im Vergleich zu nicht rauchenden Kontrollen. Das DAGAR-Silencing förderte eine Abnahme der Expression von SMC-Markern, was auf Defekte bei der Umwandlung dieser Zellen in einen differenzierten Phänotyp hinweist, was mit einer Zunahme der Proliferation einherging. Der Pulldown von DAGAR durch die Verwendung von 3'-biotinylierten DNA-Sonden, die zu seiner Sequenz komplementär sind (raPOOLs, siTOOLs), gefolgt von Massenspektrophotometrie, bewies seine Wechselwirkung mit Proteinen der m6A-Methylierungsmaschinerie. In Korrelation mit diesen Daten zeigten Experimente zur m6A-Immunpräzipitation (IP) aus Gesamt-RNA, dass DAGAR m6A-modifiziert war. Darüber hinaus stieg die DAGAR-Expression nach YTHDF2-Silencing sowohl in MRC5-Lungenfibroblasten als auch in SMC signifikant an. Darüber hinaus wurde während der SMC-Differenzierung eine deutliche Abnahme nicht nur von YTHDF2, sondern auch von YTHDF1 und YTHDF3 festgestellt. Die Immunpräzipitation von YTHDF2, gefolgt von einer tiefen RNA-Sequenzierung (RIP-Seq), zeigte eine spezifische Anreicherung von Transkripten, die mit der SMC-Identität und -Biologie assoziiert sind, wie unter anderem die Myosin-Schwerkette der glatten Muskulatur (MYH11) und Mitglieder der TGFβ-, PDGF- und VEGF-Signalwege . Bemerkenswerterweise förderte YTHDF2-Silencing in SMC eine Zunahme der Expression von SMC-spezifischen Markern. Wir schließen daraus, dass der SMC-Phänotyp durch die lange nicht-kodierende RNA DAGAR und durch die Modulation des m6A-Reader-Proteins YTHDF2 reguliert wird.
Metadaten zuletzt geändert: 10 Aug 2022 13:36
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