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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-529880
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.52988
Abstract (English)
In metabolomics, stable isotope labeling experiments with tracer isotopes like ¹³C or ¹⁵N can provide very valuable information. This includes, for example, the assessment of nutrient contributions to the synthesis of certain metabolites, contributions to metabolic pathways, or the estimation of metabolic fluxes via formal metabolic flux analysis. However, if mass spectrometry (MS) data from ...
Abstract (English)
In metabolomics, stable isotope labeling experiments with tracer isotopes like ¹³C or ¹⁵N can provide very valuable information. This includes, for example, the assessment of nutrient contributions to the synthesis of certain metabolites, contributions to metabolic pathways, or the estimation of metabolic fluxes via formal metabolic flux analysis. However, if mass spectrometry (MS) data from stable isotope labeling experiments is used without a prior correction for the abundance of naturally occurring stable heavy isotopes, and, possibly, the isotopic purity of the tracer substrate, this may lead to incorrect conclusions and flux estimates. This is because the mass shift introduced by the incorporation of the tracer isotope into the measured metabolites is also produced naturally, due to the natural abundance (NA) of stable heavy isotopes like ¹³C, ¹⁵N, ²H or ¹⁸O. Similarly, isotopic impurity of the tracer substrate can lead to a "loss" of label and mass shift, which also distorts the measured data. IsoCorrectoR, which is presented with this thesis, is a comprehensive R-based solution for the correction of stable isotope labeling data for NA and tracer purity. While there are already several tools available for that purpose, for example IsoCor (v2), ICT or PyNAC, IsoCorrectoR brings the advantage of combining many state-of-the-art correction features in a single implementation. This includes the low-resolution and resolution-dependent NA correction of MS and MS/MS (tandem MS) data, the NA correction of ultra-high resolution (UHR) data from experiments employing multiple tracer isotopes (e.g., ¹³C and ¹⁵N) simultaneously, as well as tracer purity correction and the applicability to any tracer isotope. Additionally, two modes of correction that IsoCorrectoR offers are unique, or were unique at the date of initial publication. The first is a UHR correction approach for UHR data from multiple-tracer experiments that also accounts for tracer purity. Correction for tracer purity can be crucial, especially in the case of multiple tracer isotopes, where impurities of different tracers may add up. While IsoCorrectoR was the first tool to provide this correction feature, the very recently published correction tool AccuCor2 is also capable of correcting multiple-tracer data for tracer purity. It however performs resolution-dependent correction, and not UHR correction. The second novel mode that IsoCorrectoR offers is the resolution-dependent correction of MS/MS data. If MS/MS data is corrected with a MS correction algorithm, this can result in substantial deviations. As a consequence, a correction approach specifically suited for MS/MS data must be applied. If MS/MS data is additionally acquired at high resolution (e.g., with orbitrap or FT-ICR devices), the correction procedure must adapt to this situation as well. In low-resolution correction, all natural abundance contributions that match the nominal mass shift resulting from tracer isotope incorporation are corrected for. In contrast, when applying resolution-dependent correction, natural abundance contributions are considered for correction depending on the instrument resolution at the given molecular ion or fragment m/z, because some of the NA contributions can already be resolved spectrometrically and, therefore, do not have to be corrected for. This is taken into account in resolution-dependent MS (which is also available in other tools, e.g., IsoCor v2) and MS/MS correction (which is a unique feature of IsoCorrectoR), and can have marked effects on the correction results. To ensure correct functioning, IsoCorrectoR has been thoroughly validated against other available tools (where possible), manual calculations and validation mixtures of known isotopologue composition, all of which yielded very good agreement. As an application of isotope correction, a ¹³C stable isotope labeling experiment conducted in P493-6 B-cells is part of this thesis. These cells have an inducible MYC allele, where the quickly proliferating MYC-high state may serve as a model for Burkitt lymphomas, while the hardly proliferating MYC-low state resembles normal B-cells. Combined addition of the microenvironmental factors IL10 and CpG to MYC-low cells induces proliferation, however, and this cellular state may also serve as a model for certain B-cell lymphomas.
Translation of the abstract (German)
Im Metabolomics-Bereich können Experimente mit stabilen Isotopen-Labels wie ¹³C oder ¹⁵N sehr wertvolle Informationen liefern. Das schließt beispielsweise die Bestimmung von Beiträgen eines bestimmten Nährstoffs zur Synthese bestimmter Metabolite, Beiträge zu metabolischen Pathways, oder die Schätzung von metabolischen Fluxes mittels formaler Metabolic Flux Analysis mit ein. Wenn ...
Translation of the abstract (German)
Im Metabolomics-Bereich können Experimente mit stabilen Isotopen-Labels wie ¹³C oder ¹⁵N sehr wertvolle Informationen liefern. Das schließt beispielsweise die Bestimmung von Beiträgen eines bestimmten Nährstoffs zur Synthese bestimmter Metabolite, Beiträge zu metabolischen Pathways, oder die Schätzung von metabolischen Fluxes mittels formaler Metabolic Flux Analysis mit ein. Wenn massenspektrometrische Daten aus Experimenten mit stabilen Isotopen-Labels jedoch ohne vorherige Korrektur auf die Abundanz natürlich vorkommender stabiler schwerer Isotope, und, falls gegeben, auf die isotopische Unreinheit des Tracer-Substrats verwertet werden, kann das zu falschen Schlüssen und falschen Flux-Schätzungen führen. Das liegt daran, dass der Massenshift, der durch die Inkorporation der Tracer-Isotope in die gemessenen Metabolite erzeugt wird, auch natürlicherweise produziert wird, aufgrund der natürlichen Abundanz (NA) von stabilen schweren Isotopen wie ¹³C, ¹⁵N, ²H oder ¹⁸O. In ähnlicher Weise führen isotopische Unreinheiten des Tracer-Substrats zu einem „Verlust“ von Label und Massenshift, was ebenfalls die gemessenen Daten verzerrt. IsoCorrectoR, das im Rahmen dieser Arbeit präsentiert wird, ist eine umfassende R-basierte Lösung für die Korrektur von Daten aus Experimenten mit stabilen Isotopen-Labels auf NA und Tracer-Reinheit. Während bereits verschiedene Tools für diesen Zweck vorhanden sind, etwa IsoCor (v2), ICT oder PyNAC, bringt IsoCorrectoR den Vorteil mit sich, viele State-of-the-Art Korrektur-Features in einer einzigen Implementierung zu vereinen. Das schließt die Niedrigauflösungs- und auflösungsabhängige NA Korrektur von MS und MS/MS (Tandem-MS) Daten, die NA Korrektur von ultrahochauflösenden Daten aus Experimenten, in denen verschiedenen Tracer-Isotope (z.B. ¹³C und ¹⁵N) simultan genutzt werden, sowie Tracer-Reinheits-Korrektur und die Anwendbarkeit auf jedes Tracer-Isotop mit ein. Zusätzlich dazu sind zwei der Korrekturmodi, die IsoCorrectoR bietet, einzigartig, oder waren zum Zeitpunkt der ursprünglichen Publikation einzigartig. Der erste Modus ist ein Ultrahochauflösungs-Korrekturansatz für ultrahochauflösende Daten aus Experimenten mit multiplen Tracern, der auch Tracer-Unreinheit adressiert. Die Korrektur auf Tracer-Unreinheit ist essentiell, besonders im Fall von multiplen Tracer-Isotopen, wo sich Unreinheiten der verschiedenen Tracer aufaddieren können. Während IsoCorrectoR das erste Tool war, das dieses Korrektur-Feature lieferte, kann das kürzlich publizierte Korrekturtool AccuCor2 ebenfalls Daten aus Experimenten mit multiplen Tracern im Hinlick auf Tracer-Unreinheit korrigieren. Es führt allerdings eine auflösungsabhängige Korrektur durch, keine Ultrahochauflösungs-Korrektur. Der zweite neuartige Korrekturmodus, den IsoCorrectoR bietet, ist die auflösungsabhängige Korrektur von MS/MS-Daten. Wenn MS/MS-Daten mit einem MS-Korrekturalgorithmus korrigiert werden, können daraus substantielle Abweichungen resultieren. Entsprechend muss ein Korrekturansatz gewählt werden, der speziell auf MS/MS-Daten zugeschnitten ist. Wenn MS/MS-Daten zudem mit hoher Auflösung aufgenommen werden (etwa mit Orbitrap- oder FT-ICR-Geräten), muss die Korrekturprozedur sich dieser Situation ebenfalls anpassen. Bei der Niedrigauflösungs-Korrektur wird auf alle NA-Beiträge, die denselben nominalen Massenshift haben wie der, der aus der Inkorporation des Tracer-Isotopes resultiert, korrigiert. Im Gegensatz dazu wird, wenn auflösungsabhängige Korrektur angewendet wird, in Abhängigkeit von der Instrumenten-Auflösung bei einem gegebenen Molekülion- oder Fragment-m/z-Verhältnis auf NA-Beiträge korrigiert. Der Grund dafür ist, dass manche NA-Beiträge bereits spektrometrisch aufgelöst werden können, und man entsprechend nicht für sie korrigieren muss. Das wird bei der auflösungsabhängigen MS-Korrektur (die auch von anderen Tools wie IsoCor v2 angeboten wird) und MS/MS-Korrektur (die ein einzigartiges Feature von IsoCorrectoR ist) berücksichtigt, und kann ausgeprägten Einfluss auf die Korrekturergebnisse haben. Um ein korrektes Funktionieren sicherzustellen, wurde IsoCorrectoR gründlich gegen andere Tools (wo immer möglich), manuelle Berechnungen und Validierungsmixturen bekannter Zusammensetzung validiert. All das resultierte in guter Übereinstimmung. Als eine Anwendung der Isotopen-Korrektur ist ein ¹³C-Stabil-Isotopen-Labeling-Experiment, das mit P493-6 B-Zellen durchgeführt wurde, teil dieser Arbeit. Diese Zellen haben ein induzierbares MYC-Allel. Dabei kann der schnell proliferierende MYC-high-Zustand als ein Modell für Burkitt-Lymphome fungieren, während der kaum proliferierende MYC-low-Zustand normalen B-Zellen ähnelt. Die kombinierte Gabe der Microenvironment-Faktoren IL10 und CpG zu MYC-low-Zellen induziert hingegen Proliferation, und dieser zelluläre Zustand kann ebenfalls als ein Modell für bestimmte B-Zell-Lymphome dienen.
Metadata last modified: 07 Nov 2022 07:50
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