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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-530147
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.53014
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 2 Oktober 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Tag der Prüfung: | 29 September 2022 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Stichwörter / Keywords: | Impedanzbasierte Zellanalytik, Heterogenität, GPCR |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 53014 |
Zusammenfassung (Englisch)
Many in vitro studies for drug development are based on population-averaging measurement techniques without giving information about cell-to-cell variability within the cell ensembles under study. However, such heterogeneities in cell cultures are omnipresent and can arise by several causes, like spontaneous genetic mutations, different metabolic situations or different cell cycle states of ...
Zusammenfassung (Englisch)
Many in vitro studies for drug development are based on population-averaging measurement techniques without giving information about cell-to-cell variability within the cell ensembles under study. However, such heterogeneities in cell cultures are omnipresent and can arise by several causes, like spontaneous genetic mutations, different metabolic situations or different cell cycle states of individual cells. Moreover, microenvironmental conditions, like cell crowding, might force cell ensembles to form subpopulations with distinct characteristics. Therefore, single phenotypically different subpopulations may be overseen or averaged responses across different subpopulations might not reflect the majority of the cells, leading to misinterpretations of data – one possible reason for the high failure rate in clinical trials.
This thesis addressed the fundamental question of how cell-to-cell variability in populations influence the signal of population-based assays by using three different approaches. The first project addressed the impact of evenly distributed heterogeneities within cell populations, introduced by mixing a cell line expressing a certain G protein-coupled receptor (GPCR) with a cell line not expressing this receptor type, on the impedance-based cell analysis. The second project focused on the development of an impedance-based assay for the future purpose of spatiotemporally introducing heterogeneities in an isogenic cell population, expressing a certain GPCR, by switching an appropriate, photochromic ligand by illumination. The third project addressed the quantification of the impact of heterogeneities within cell populations on the impedance-based cell analysis in a theoretical manner.
The first project focused on the impact of cell-to-cell variability on the population-based impedance signal by mixing cell lines in different ratios prior to the seeding onto the co-planar gold electrodes. The evenly distributed heterogeneities in the resulting cell populations were generated by co-culturing two cell lines with one of them expressing a GPCR predominantly coupled to one of the three main canonical G-protein pathways (Gq, Gs, Gi/o). A protocol was established to obtain co-cultures with distinct cell ratios resulting in well-defined areal receptor densities (ARD) as verified by supported microscopic staining studies. The stimulation of cell ensembles with varying ARD by the GPCR's endogenous ligands was analyzed in detail by wholistic impedance-based cell assays. Efficacies and potencies, which describe the maximal agonist effect and the activity of a drug, were compared to those of the pure and original cell lines. It was shown that both parameters were dependent on the ARD and the coupled signaling cascades in distinct ways: for the Gq pathway, efficacy decreased non-linearly with decreasing ARD, while the Gs- and Gi/o-pathways exhibited an almost linear dependency of efficacy on the ARD. The potencies observed for the Gq- and Gi/o-coupled signaling pathway decreased with decreasing ARD, while the potency of the Gs-pathway was almost independent of the ARD. Simple simulations indicated that underlying communication processes between stimulated and non-stimulated cells within the populations under study may be responsible for these trends.
Additionally, two proximal assay techniques were used to assist the interpretation of impedance analysis and to assign the impact of the ARD on the signal to a certain part of the signaling cascade. The radioligand competition binding assay confirmed the correct co-culturing strategy for such heterogeneous cell populations and confirmed the corresponding potency to be independent of the population composition. Population-based Ca2+ imaging highlighted the impact of altering the ARD on second messenger mobilization. Again, the ARD did not affect the potency, but the analysis of the response on a single-cell level proposed cell communication as a potential mechanism explaining the dependency of impedance on ARD.
Moreover, the stimulation of a co-culture, consisting of two GPCR-expressing cell lines, was analyzed impedimetrically. The outcomes indicated that the potency dependency on the ARD was caused by the simultaneous activation of two different signaling pathways. The obtained data confirmed that the impact of artificially introduced heterogeneities in the cell population under study on the obtained impedance signal was indeed significant. Nevertheless, it remains elusive, whether these results can be translated to other cell lines or other GPCRs. This project addressed the fundamental question of areal heterogeneities influencing the impedance signal. However, further studies on cell ensembles with different compositions and other measurement techniques have to be carried out to obtain a broader picture of such impacts on population-based measurements and its significance for the drug development process.
In the second project of this thesis, an assay was developed for the future purpose of introducing cell-to-cell variability within isogenic cell populations by spatiotemporal illumination of photochromic GPCR-ligands, which can be toggled between their bioactive and -inactive isomer. Thus, it was required to establish a protocol to active in situ such a ligand by online irradiation with light and to monitor the cell responses in a time-resolved manner. The wholistic impedance-based cell assay was appropriate to monitor the in situ toggling of a model photoswitchable ligand for a Gq-coupled receptor. To accomplish the superordinate goal, it will be necessary to establish a measurement setup, which is capable of spatiotemporal illumination of the cell culture, so that a small subpopulation can be stimulated in a spatiotemporally well-defined manner after the systemic addition of the bioinactive species of a photoswitchable ligand.
The third part of this thesis addressed the impact of heterogeneous cell populations on the impedance readout by theoretical means. For this purpose, a MATLAB-based algorithm was developed, capable of simulating different cell types following the electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) model. In contrast to the conventional mode, which assumes global cell-related parameters (α for the cell-substrate contacts, Rb for the cell-cell contacts, Cm for the cell membrane capacitances) for the whole population, the new approach emulated cell populations by cell-related parameters, each showing a Gaussian distribution with a mean and a deviation value. After successful validation of the underlying algorithm, discrepancies from the ECIS model using global parameters were found for such populations with heterogeneous cell-related parameters for three distinct cell types, emulating leaky, moderately tight, and tight cells. Especially the deviation of the Gaussian-distributed parameters α and Rb had a big impact on the spectra. In direct comparison to the reference, which was a homogenous cell population with global parameter values being equal to the mean values of the Gaussian distribution, a systematical misestimation could be found for α (up to 110 % of the reference value) and underestimation for Rb (down to 78 % of the reference value) when the deviation values were set to 30 % of the mean values. In contrast, Cm was found to be very robust for deviations up to 30 % (100 % of the reference value).
In summary, the thesis has demonstrated in an experimental and theoretical manner that cell-to-cell variability has indeed major impacts on the population-based impedance signal, having the potential to misdirect data interpretation. These can affect fundamental as well as pharmacological research. Thus, it is crucial to address such heterogeneities within cell populations in future studies using population- as well as single-cell-based assay techniques.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In vitro Studien der Medikamentenentwicklung basieren häufig auf Messtechniken, welche die mittlere Zellantwort einer Population aufzeichnen, aber keine Informationen über das Auftreten von Unterschieden individueller Zellen innerhalb eines Zellensembles berücksichtigen. Allerdings sind Unterschiede zwischen Zellen omnipräsent und können durch verschiedene Mechanismen ausgelöst werden, z.B. durch ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In vitro Studien der Medikamentenentwicklung basieren häufig auf Messtechniken, welche die mittlere Zellantwort einer Population aufzeichnen, aber keine Informationen über das Auftreten von Unterschieden individueller Zellen innerhalb eines Zellensembles berücksichtigen. Allerdings sind Unterschiede zwischen Zellen omnipräsent und können durch verschiedene Mechanismen ausgelöst werden, z.B. durch spontane genetische Mutationen, unterschiedliche metabolische Zustände oder dem Vorhandensein von Zellen in unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus. Außerdem kann die Mikroumgebung, z.B. aufgrund unterschiedlicher Zelldichte, dazu führen, dass Subpopulationen mit verschiedenen Charakteristiken innerhalb der übergeordneten isogenen Population entstehen. Dies kann in Messtechniken, welche die gemittelte Zellantwort aufzeichnen, dazu führen, dass das erhaltene Signal nicht der Zellantwort kleinerer Subpopulationen entspricht oder sogar, aufgrund der Populationszusammensetzung, die Reaktion der Mehrheit der Zellen nicht richtig wiedergegeben wird. Dies wiederum kann zu fehlgeleiteten Interpretationen der Datenlage führen und könnte auch ein Grund für die hohe Fehlerrate von präklinischen Studien sein.
Diese Arbeit adressierte mit drei verschiedenen Ansätzen die fundamentale Frage, wie phänotypische Unterschiede auf zellulärer Ebene das Signal von Populations-basierten Assaytechniken beeinflussen. Das erste Projekt adressierte den Einfluss von gleichmäßig verteilten Heterogenitäten in Zellpopulationen, welche durch die Mischung von Zellen, die einen bestimmten G Protein gekoppelten Rezeptor exprimieren, mit Zellen, die diesen nicht exprimieren, auf die Impedanz-basierte Zellanalyse. Das zweite Projekt fokussierte sich auf die Entwicklung eines Impedanz-basierten Zellassays für den zukünftigen Zweck, spatiotemporal Heterogenitäten in isogenen Zellpopulationen, welche einen bestimmten GPCR exprimieren, einzufügen, indem ein entsprechender, photochromer Ligand durch Belichtung reversibel geschaltet werden kann. Das dritte Projekt konzentrierte sich als Simulationsstudie auf die Quantifizierung des Einflusses von Heterogenitäten in Zellpopulationen auf die Impedanz-basierte Zellanalytik.
Das erste Projekt befasste sich mit der Variabilität in der Expression von G protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) in in vitro Populationen unterschiedlicher Zellen. Dabei wurden zwei Zelllinien, wobei eine von ihnen einen Modell GPCR exprimierte, welcher hauptsächlich mit einem der drei kanonischen Signalkaskaden (Gq, Gs, Gi/o) koppelt, gleichmäßig in einer Co-Kultur mit Zellen, welche diesen Rezeptor nicht exprimieren, verteilt. Anschließend wurde der Einfluss unterschiedlicher Zusammensetzungen dieser Co-Kulturen auf das Impedanzsignal untersucht. Es wurde initial ein Protokoll entwickelt, um Co-Kulturen mit definierten Zellverhältnissen zu generieren, was durch mikroskopische Färbestudien validiert wurde. Die Stimulation dieser gemischten Populationen mit unterschiedlichen Rezeptordichten (ARD) unter Verwendung entsprechender Liganden wurde mit dem integralen Impedanz-basierten Zellassay aufgezeichnet. Die erhaltenen Wirksamkeiten und Potenzen, Maße für die maximal Agonisteffizienz und -aktivität, wurden mit denen der homogenen Zellpopulationen verglichen. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass beide Parameter auf unterschiedliche Weise von der jeweiligen ARD abhingen: Während die Agonisteffizienz der Gq-gekoppelten Signalkaskaden nicht-linear mit abnehmender ARD sanken, nahmen die Gs- und Gi/o-bezogenen Wirksamkeiten linear ab. Die Potenzen der Gq- und Gi/o-gekoppelten Signalwege sanken mit abnehmender ARD, während die der Gs-gekoppelten Signalkaskade nahezu unabhängig von der ARD waren. Einfache Simulationsstudien deuteten an, dass interzelluläre Kommunikation zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Zellen die Ursache für diese Trends sein könnten.
Die Radioligand-Bindungsstudien bestätigten die Korrektheit des neuetablierten Co-Kultivierungsprotokolls und zeigten außerdem, dass die zugehörige Potenz nicht von der ARD abhing. Das Populations-basierte Ca2+ Imaging wurde exemplarisch durchgeführt, um den Einfluss der ARD auf die Mobilisierung des Second Messengers Ca2+ zu untersuchen. Wieder hatte die ARD nahezu keinen Einfluss auf die entsprechende Potenz. Allerdings konnte durch Einzelzellanalyse der zugehörigen Daten aufgezeigt werden, dass eine Kommunikation zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Zellen wahrscheinlich die beobachtete Abhängigkeit der ARD von der Potenz in den Impedanz-basierten Messungen verursachte. Weiterhin wurde eine Co-Kultur, welche aus zwei GPCR-exprimierenden Zelllinien bestand, impedimetrisch analysiert. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Abhängigkeit der Potenz von der Populationszusammensetzung möglicherweise durch unterschiedlich aktivierte Signalkaskaden erklärt werden könnte.
Alles in allem konnte mit diesem Projekt gezeigt werden, dass artifiziell eingeführte Heterogenitäten einen signifikanten Einfluss auf das erhaltene Impedanzsignal hatten. Die Übertragbarkeit der Ergebnisse ist Gegenstand weiterer Untersuchungen. Deswegen müssen noch weitere Studien mit anderen Messmethoden durchgeführt werden, um das Gesamtbild des Einflusses solcher Heterogenitäten auf die Messdaten zu erweitern und ebenso den Effekt auf den in vitro Anteil in der Medikamentenentwicklung bewerten zu können.
Das zweite Projekt der Arbeit fokussierte sich darauf, einen Assay zu entwickeln, welcher Variabilität auf zellulärer Ebene in isogenen Populationen einführen können soll. Dafür sollen photochrome, molekulare Schalter, welche GPCRs adressieren, zu den Zellpopulationen zugegeben und beleuchtet werden. Diese Liganden können dadurch zwischen ihrer bioaktiven und -inaktiven Spezies reversibel umgeschaltet werden. Hierbei war der erste Schritt, ein Protokoll zu entwickeln, um die zelluläre Reaktion auf das Umschalten der Liganden durch Beleuchtung in situ und zeitaufgelöst mithilfe der ausgelösten zellulären Antwort zu verfolgen. Es konnte anhand eines Modellmoleküls, welches als Agonist an einem Gq-gekoppelten Rezeptor wirkt, gezeigt werden, dass die Impedanz-basierte Zellanalytik eine geeignete Messmethodik hierfür ist.
Um das übergeordnete Ziel der lateral eingeführten Unterschiede auf zellulärer Ebene in isogenen Populationen zu erreichen, ist es zukünftig nötig, ein Mess-Setup zu entwickeln, welches die spatiotemporale Anregung der Probe ermöglicht, um nach der systemischen Zugabe der bioinaktiven Spezies des photochromen Liganden eine kleine Subpopulation räumlich definiert zu stimulieren und somit den Einfluss solcher Heterogenitäten auf das Messsignal evaluieren zu können.
Der dritte Teil der Arbeit adressierte den Einfluss von Subpopulationen in isogenen Zellensembles auf das Impedanzsignal mittels einer theoretischen Studie. Hierfür wurde ein MATLAB-basierter Algorithmus entwickelt, welcher in der Lage war, verschiedene Zelltypen gemäß dem electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Modell zu simulieren. Im Gegensatz zum konventionellen Ansatz, welcher für alle Zellen gleiche, globale zellbezogene Parameter (α für die Zell-Substrat Kontakte, Rb für die Zell-Zell Kontakte, Cm für die Zellmembrankapazitäten) voraussetzt, emuliert der neuentwickelte Algorithmus heterogene Zellpopulationen, indem die drei zellbezogenen Parameter einer Gauß’schen Verteilung (jeweils mit Mittelwert und Abweichung) genügen. Nachdem der Algorithmus erfolgreich validiert wurde, wurden beim Vergleich von heterogenen und homogenen Zellpopulationen Abweichungen in den Daten für drei verschiedene Zelltypen (undichte, mitteldichte und dichte Zellen) gefunden. Vor allem die Abweichung der Gauß-verteilten Parameter α und Rb zeigten einen großen Effekt auf die berechneten Spektren. Im direkten Vergleich zur Referenz, einer homogenen Zellpopulation mit globalen zellbezogenen Parametern, deren Werte gleich der Mittelwerte der Gauß’schen Verteilung waren, konnte eine systematische Fehlbestimmung von α (bis zu 110 % des Referenzwertes) und eine systematische Unterbestimmung von Rb (bis zu 78 % des Referenzwertes) gefunden werden, wenn die Abweichungswerte auf 30 % der Mittelwerte gesetzt wurden. Im Gegensatz hierzu zeigte sich Cm als sehr robust gegenüber Abweichungswerten von bis zu 30 % der Mittelwerte (100 % des Referenzwertes).
Zusammengefasst haben diese drei Projekte sowohl experimentell als auch theoretisch aufgezeigt, dass zelluläre Unterschiede innerhalb einer Population einen signifikanten Einfluss auf die erhaltenen Impedanzdaten haben können. Diese Effekte können die Grundlagen- genauso wie die pharmakologische Forschung deutlich beeinträchtigen. Deswegen ist es unbedingt erforderlich, solche Heterogenitäten in zukünftigen Studien mit Label-basierten sowie mit Label-freien Techniken zu adressieren, um das Wissen um entstehende Auswirkungen auf die Ergebnisse zu erweitern und vorteilhafte Schlüsse für die Medikamentenforschung und das Design neuer Messtechniken und -protokolle ziehen zu können.
Metadaten zuletzt geändert: 02 Okt 2023 06:52
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