![[img]](https://epub.uni-regensburg.de/style/images/fileicons/application_pdf.png) | License: Publishing license for publications excluding print on demand (57MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-532053
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.53205
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 November 2023 |
| Referee: | Prof. Dr. Christine Ziegler |
| Date of exam: | 3 November 2022 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Christine Ziegler |
| Keywords: | Cryo-electron microscopy, stress response, Osmostress, environmental stress, ER stress |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 53205 |
Abstract (English)
Stress can be considered as one of the most fundamental aspects in life, and all living organisms are constantly exposed to a variety of different stress situations. Thus, efficient stress sensing and reaction mechanisms are crucial for their survival. Stress response mechanisms are as diverse as the causative stimuli and oftentimes cross-linked forming a versatile reaction network, to ensure the ...
Abstract (English)
Stress can be considered as one of the most fundamental aspects in life, and all living organisms are constantly exposed to a variety of different stress situations. Thus, efficient stress sensing and reaction mechanisms are crucial for their survival. Stress response mechanisms are as diverse as the causative stimuli and oftentimes cross-linked forming a versatile reaction network, to ensure the cells’ survival under critical situations. Notably, stress response mechanisms play a major role in pathogenicity, virulence and disease. Pathogenic Bacteria are permanently facing environmental pressure originating from the host’s defense systems or drug treatments, while mutations in eukaryotic stress response systems have been shown to cause a large number of severe human diseases such as diabetes, cancer or Parkinson’s and Alzheimer’s disease. A profound molecular knowledge on the respective mechanisms is thus the inevitable prerequisite towards a global understanding of this fundamental aspect of life, paving the way for the development of new drugs or therapeutic approaches.
Within this thesis, various aspects of stress response mechanisms in three different systems were investigated using state-of-the-art electron microscopy techniques. First, I set out to solve the structure of the Vibrio vulnificus stressosome complex, a key player in the bacterial environmental stress response. Currently, there is no structural data available for any gram-negative stressosome. A medium-resolution cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of the minimal complex could be obtained, which features an exceptional symmetry break originating from its unique, regulatory stoichiometry. Based on the structural data, it was possible to propose an activation mechanism and to pinpoint a number of significant differences in comparison to gram-positive stressosome complexes. Undoubtedly, the structure contributes a major piece of information necessary to understand stress sensing and signal transduction in this human pathogen. This study was complemented by a number of physiological and phylogenetic experiments contributed by our co-workers, and published recently (VIII. PUBLICATION 1).
The second project focused on the gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum, a prime model organism for investigations of the bacterial osmostress response. Sensing of hyper-osmotic stress and regulation of the respective stress response in C. glutamicum are simultaneously performed by BetP, a conformationally asymmetric-trimeric secondary active transporter able to import the compatible solute betaine. Two stimuli are identified to initiate the full osmostress response in BetP, namely an elevated cytoplasmic K+ concentration and a loosely defined ‘membrane stimulus’. Despite the availability of functional data on BetP regulation, structural information especially of the down-regulated state and the subsequent transition events are absent. Using single particle cryo-EM analysis, I was able to provide high-resolution structures of the down-regulated and a transition state, which elucidated a number of important structural features not described so far. It could be shown that down-regulated BetP adopts a symmetric arrangement stabilized by antight cytoplasmic interaction network of the sensory domain, further strengthened by Cardiolipin molecules located at regulatory lipid binding sites. These constraints are released upon stress sensing, as demonstrated by fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and molecular dynamics simulation (MD) data contributed by our co-workers, resulting in the well-established, asymmetric-trimeric structures previously known. The wealth of new data on the down-regulated state allowed to propose a detailed regulation mechanism and to further sharpen the previously vague picture of the membrane stimulus. The data are summarized and presented in IX. PREPRINT 1.
A third topic of this thesis was the three dimensional investigation via dual-axis scanning transmission electron microscopy (STEM) tomography of crystalloid-ER structures we identified before in human embryonic kidney (HEK) cells upon over-expression of polycystin-2 (PC-2). In this study presented in X. MANUSCRIPT 1, I was further able to proof the presence of ER whorls, and to obtain high-resolution three-dimensional (3D) reconstructions of the two different ER morphotypes. These data provided unmatched insights into the cellular ER interaction partners and clearly demonstrated the dynamic nature of the organelle even under stress situations. A detailed discussion of the identified morphological features in their respective cellular context finally allowed for the description of the organellar membrane architecture at a high level of detail.
Lastly, the discussion addresses the electron microscopy techniques and instruments used and contains an outlook on further perspectives for the projects. Overall, this thesis yielded intriguing mechanistic insights into the versatile bacterial and eukaryotic stress response mechanisms, reflecting their manifold nature ultimately converging to a common outcome.
Translation of the abstract (German)
Stress stellt einen fundamentalen Bestandteil des Lebens an sich dar, und alle Lebewesen sind kontinuierlich den unterschiedlichsten Stress-Situationen ausgesetzt. Ein effizientes Erkennen von Stress und die jeweiligen Reaktionen darauf sind daher überlebensnotwendig. Die Stressantworten sind dabei so vielfältig wie die entsprechenden Stimuli und oftmals eng miteinander verflochten; so entsteht ...
Translation of the abstract (German)
Stress stellt einen fundamentalen Bestandteil des Lebens an sich dar, und alle Lebewesen sind kontinuierlich den unterschiedlichsten Stress-Situationen ausgesetzt. Ein effizientes Erkennen von Stress und die jeweiligen Reaktionen darauf sind daher überlebensnotwendig. Die Stressantworten sind dabei so vielfältig wie die entsprechenden Stimuli und oftmals eng miteinander verflochten; so entsteht ein höchst wirksames Reaktionsnetzwerk, welches das Überleben von Organismen in kritischen Situationen sicherstellt. Insbesondere in Bezug auf Pathogenität, Virulenz und Krankheit spielen solche Mechanismen eine große Rolle. Beispielsweise werden pathogene Bakterien permanent von Abwehrmechanismen des Wirtsorganismus oder durch medikamentöse Behandlung unter Druck gesetzt. Zudem ist bekannt dass Mutationen in eukaryotischen Stressabwehr-Systemen schwere Krankheiten wie Diabetes, bestimmte Formen von Krebs, Alzheimer oder die Parkinson’sche Krankheit auslösen können. Ein molekulares Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen ist daher der notwendige erste Schritt auf dem Weg zur Entwicklung neuer Wirkstoffe oder therapeutischer Ansätze.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte von Stressantwort-Mechanismen in drei Systemen mit Hilfe aktuellster elektronenmikroskopischer Techniken untersucht. Zuerst ist es gelungen, die Struktur des Stressosom-Komplexes aus Vibrio vulnificus aufzuklären, einem zentralen Komplex der bakteriellen Umweltstress-Antwort. Strukturelle Daten gram-negativer Stressosom-Komplexe waren bis zu diesem Zeitpunkt nicht verfügbar. Die erzielte kryo-EM Struktur mittlerer Auflösung des Minimal-Komplexes zeigt einen außergewöhnlichen Symmetrie-Bruch, welcher in der einzigartigen Stöchiometrie mit regulierender Funktion begründet ist. Basierend auf den strukturellen Daten konnten ein Aktivierungs-Mechanismus vorgeschlagen, sowie signifikante Unterschiede zu gram-positiven Stressosom-Komplexen aufgezeigt werden. Somit stellt die Struktur unzweifelhaft einen bedeutsamen Beitrag zum Verständnis der Stress-Wahrnehmung und Signalübersetzung in diesem humanpathogenen Bakterium dar. Die Studie konnte durch eine Reihe physiologischer und phylogenetischer Experimente unserer Mitautoren ergänzt und kürzlich veröffentlicht werden (VIII. PUBLICATION 1).
Das zweite Projekt beschäftigte sich mit dem gram-positiven Boden-Bakterium Corynebacterium glutamicum, einem Modellorganismus zur Untersuchung der bakteriellen Osmostress-Antwort. In C. glutamicum werden sowohl die Wahrnehmung von hyper-osmotischem Stress als auch die Regulation der entsprechenden Antwort durch BetP erreicht, einem konformationell asymmetrisch-trimeren Sekundärtransporter welcher für den Import des kompatiblen Solutes Betain verantwortlich ist. Zwei Stimuli werden benötigt, um die vollständige Stress-Antwort auszulösen: eine erhöhte cytoplasmatische K+-Konzentration, sowie ein vage definierter „Membran-Stimulus“. Trotz zahlreicher Daten zur Regulation von BetP fehlen strukturellen Informationen zum herunterregulierten Zustand. Mithilfe der kryo-EM Einzelteilchenanalyse konnte ich hochauflösende Strukturen des herunterregulierten sowie eines Übergangs-Zustandes beitragen, die wichtige strukturelle Details aufklärten. Es zeigte sich, dass BetP im herunterregulierten Zustand symmetrisch ist, und dass dieser Zustand durch ein enges, cytoplasmatisches Interaktionsnetzwerk der Sensor-Domänen stabilisiert wird, welches wiederum durch Cardiolipin-Moleküle an regulatorischen Lipid-Bindestellen verstärkt wird. Daten unserer Co-Autoren bestätigten, dass dieser Zustand unter Stressbedingungen schrittweise gelöst wird, was in der bekannten, asymmetrischen Struktur resultiert. Diese Daten – zusammen-gefasst in IX. PREPRINT 1 – sind die Basis für einen detaillierten Regulations-Mechanismus und ermöglichten auch eine genauere Definition des Membranstimulus.
Ein dritter Gegenstand dieser Arbeit bestand in der dreidimensionalen Untersuchung von durch PC-2 Überexpression in HEK-Zellen verursachten kristalloid-ER Strukturen mittels Doppelachsen-STEM-Tomografie. In dieser Studie, nachzulesen in X. MANUSCRIPT 1, konnte ich zudem die Existenz von sog. ER whorls nachweisen, sowie hochauflösende 3D-Rekonstruktionen der beiden Morphotypen erzielen. Diese Daten gewährten bisher unbekannte Einblicke in das intrazelluläre Interaktions-Netzwerk und zeigten klar die hochdynamischen Eigenschaften dieses Organells, sogar unter Stressbedingungen, auf. Eine präzise Darstellung der jeweiligen morphologischen Charakteristika in ihrem zellulären Umfeld ermöglichte schließlich die Beschreibung der Membranarchitektur der Organellen mit einem bisher nicht gekannten Detailgrad.
Schließlich beschäftigt sich die Diskussion mit einem Vergleich der verschiedenen elektronenmikroskopischen Techniken und Methoden, welcher auch einen Ausblick auf zukünftige Experimente erlaubt. Zusammengefasst war es im Rahmen dieser Arbeit möglich, vielfältige Einblicke in unterschiedliche Stressantwort-Mechanismen zu erhalten, die schlussendlich jedoch erfolgreich ein gemeinsames Ziel verfolgen.
Metadata last modified: 16 Nov 2023 07:42
Owner only: item control page
Download Statistics