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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-536279
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.53627
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 24 January 2024 |
| Referee: | PD Dr. Max Keller |
| Date of exam: | 23 December 2022 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Peptidic neurotensin receptor ligands; tumor imaging; PET; plasma stability; peptidic CXCR4 ligands; |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 53627 |
Abstract (English)
The neuropeptide neurotensin (NT), mainly expressed in the CNS and the gastrointestinal tract, is involved in, e.g., the regulation of feeding, body temperature and nociception. One of the NT receptors, the G-protein coupled neurotensin receptor 1 (NTS₁R), represents an interesting target concerning tumor diagnosis and therapy, as its overexpression was reported for a variety of tumors such as ...
Abstract (English)
The neuropeptide neurotensin (NT), mainly expressed in the CNS and the gastrointestinal tract, is involved in, e.g., the regulation of feeding, body temperature and nociception. One of the NT receptors, the G-protein coupled neurotensin receptor 1 (NTS₁R), represents an interesting target concerning tumor diagnosis and therapy, as its overexpression was reported for a variety of tumors such as breast cancer and pancreatic adenocarcinoma. The bioactive fragment of NT, NT(8-13), has served as a lead structure for the preparation of molecular tools useful for investigations at the NTS₁R. However, the development of radiolabeled NTS₁R ligands for in vivo applications such as tumor imaging by positron emission tomography (PET), is challenging due to proteolytic degradation of the peptidic compounds by peptidases. Therefore, appropriate structural modifications of NT(8-13) derivatives are necessary to enable an application as PET tracers.
The aim of this work was the development of stabilized analogs of NT(8-13) with high NTS₁R affinity including compounds useful for PET imaging, i.e., ¹⁸F- or ⁶⁸Ga-labeled derivatives. Therefore, a series of NT(8-13) analogs was prepared by SPPS, applying modifications such as Nα-methylation or the replacement of amino acids by non-natural amino acids. The synthesized peptides were investigated with respect to in vitro plasma stability and NTS₁R affinity.
The incorporation of amino-functionalized Nω-carbamoylated arginines instead of natural Arg enabled the conjugation of the respective NT(8-13) congeners to a prosthetic group of choice. After acylation of the amino group with 4-pentynoic acid, “cold” analogs of ¹⁸F-labeled PET tracers were prepared by click chemistry-based attachment of a fluorinated glycosyl azide onto the modified arginine side chain. Using the corresponding [¹⁸F]fluorinated azido sugar, the precursor of the most promising candidate (3.21), which showed an excellent half-life of > 24 h in vitro in human and mouse plasma and a Ki value of 4.3 nM at the NTS₁R, was used for ¹⁸F-labeling in cooperation with the Department of Nuclear Medicine, Molecular Imaging and Radiochemistry at the Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg. Biodistribution and PET imaging studies with [¹⁸F]3.21 in tumor-bearing mice revealed a high tumor-to-muscle ratio of 30 at 90 min p.i. and a specific accumulation of the tracer in subcutaneous NTS₁R-expressing HT-29 tumors. However, fast in vivo degradation of [¹⁸F]3.21 (70% degradation after 10 min p.i.) necessitates further improvement of the tracer.
Likewise, the amino-functionality of the carbamoylated arginines was used for the conjugation to chelators such as DOTA, suitable for the insertion of Ga³⁺. Considering the overall performance of the “cold” forms of these NTS₁R PET ligands (receptor affinity, plasma stability, synthetic accessibility), ⁶⁸Ga-labeled analogs of the most promising candidates were prepared in cooperation with the Department of Nuclear Medicine at the University Hospital Regensburg. UR-LS130 (compound 4.56) displayed high NTS₁R affinity (Ki = 1.2 nM) combined with excellent in vitro stability in human plasma (t1/2 > 24 h), and its radiolabeled congener [⁶⁸Ga]4.56 showed high specific accumulation in HT-29 tumors with a tumor-to-muscle ratio of 16 at 45 min p.i. in biodistribution and PET imaging studies performed with tumor-bearing mice. Notably, [⁶⁸Ga]4.56 exhibited high in vivo stability, which can be attributed to the replacement of Tyr¹¹ by β,β-dimethyl-tyrosine.
Taken together, two high-affinity NTS₁R PET ligands for tumor imaging with promising in vivo performance were developed. The identified stabilizing effect of β,β-dimethyl-tyrosine in position 11 of the peptide core structure, not affecting NTS₁R binding, will support the future development of NT(8-13)-derived tumor imaging probes.
A second project of this work aimed at fluorinated potential PET ligands for the CXCR4. This G-protein coupled chemokine receptor is overexpressed in different types of cancer, such as prostate or breast cancer. The “cold” forms of CXCR4 PET ligands derived from the reported peptidic CXCR4 antagonist FC131 were prepared by application of the replacement of Arg by an amino-functionalized Nω-carbamoylated arginine, subsequent alkyne-functionalization and coupling to the aforementioned fluoroglycosyl azide. Investigations regarding their antagonistic activities at the CXCR4 and in vitro plasma stabilities revealed that compound 5.24, displaying a pKb value of 7.15 and a half-life of > 24h, may serve as a lead structure for the development of optimized fluorinated CXCR4 PET ligands in future studies.
Translation of the abstract (German)
Das Neuropeptid Neurotensin (NT), welches hauptsächlich im ZNS und im Gastrointestinaltrakt exprimiert wird, spielt u.a. eine Rolle bei der Regulation der Nahrungsaufnahme, der Körpertemperatur und der Schmerzwahrnehmung. Einer der NT-Rezeptoren, der G Protein-gekoppelte Neurotensin-Rezeptor 1 (NTS₁R), stellt aufgrund seiner Expression in einer Reihe von Tumorarten wie Mamma- oder ...
Translation of the abstract (German)
Das Neuropeptid Neurotensin (NT), welches hauptsächlich im ZNS und im Gastrointestinaltrakt exprimiert wird, spielt u.a. eine Rolle bei der Regulation der Nahrungsaufnahme, der Körpertemperatur und der Schmerzwahrnehmung. Einer der NT-Rezeptoren, der G Protein-gekoppelte Neurotensin-Rezeptor 1 (NTS₁R), stellt aufgrund seiner Expression in einer Reihe von Tumorarten wie Mamma- oder Pankreaskarzimonen ein interessantes Target in Bezug auf Tumordiagnose und -therapie dar. Das aktive Fragment von NT, NT(8-13), diente als Leitstruktur für die Entwicklung verschiedenartiger molekularer Werkzeuge für den NTS₁R. Die Entwicklung von radioaktiv markierten NTS₁R-Liganden für in vivo-Anwendungen wie dem Tumorimaging per Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist aufgrund des proteolytischen Abbaus peptidischer Verbindungen besonders anspruchsvoll. Aufgrund dessen sind strukturelle Modifikationen der NT(8-13)-Derivate nötig, um deren Anwendung als PET-Tracer zu erlauben.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung stabilisierter NT(8-13)-Analoga mit hoher NTS₁R-Affinität, incl. Verbindungen, die fürs PET-Imaging geeignet sind, also ¹⁸F- oder ⁶⁸Ga-markierte Derivate. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von NT(8-13)-Analoga per SPPS, unter Anwendung von Modifikationen wie Nα-Methylierung oder dem Austausch natürlicher gegen unnatürliche Aminosäuren, hergestellt. Die synthetischen Peptide wurden bezüglich in vitro-Plasmastabilität und NTS₁R-Affinität untersucht.
Der Einbau von Amino-funktionalisierten, Nω-carbamoylierten Argininen anstelle von natürlichem Arg ermöglichte die Konjugation der entsprechenden NT(8-13)-Derivate mit einer funktionalisierten Gruppe. Nach der Acylierung der Aminogruppe mit 4-Pentinsäure wurden „kalte“ Analoga ¹⁸F-markierter PET-Tracer per Click-Chemie hergestellt, basierend auf der Anknüpfung eines fluorierten Azidozuckers an der modifizierten Arg-Seitenkette. Unter Verwendung des entsprechenden [¹⁸F]fluorierten Azidozuckers wurde der Precursor des vielversprechendsten Kandidaten (3.21), welcher eine exzellente Halbwertszeit von > 24 h in vitro in humanem und murinem Plasma sowie einen Ki-Wert von 4.3 nM am NTS₁R zeigte, in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Nuklearmedizin, Molekulare Bildgebung und Radiochemie an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg für eine ¹⁸F-Markierung verwendet. Studien zur Biodistribution und zum PET-Imaging mit [¹⁸F]3.21 an Tumor-Mäusen ergaben 90 min p.i. ein hohes Tumor/Muskel-Verhältnis von 30 und eine spezifische Anreicherung des Tracers in subkutanen NTS₁R-exprimierenden HT-29-Tumoren. Nichtsdestotrotz verlangt der rasche in vivo-Abbau von [¹⁸F]3.21 (70% Abbau nach 10 min p.i.) eine weitere Optimierung des Tracers.
Ähnlich dazu wurde die Amino-Funktionalität der carbamoylierten Arginine verwendet für die Anknüpfung von Chelatoren wie DOTA, die geeignet sind für den Einbau von Ga³⁺. Im Hinblick auf die Gesamt-Performance der „kalten“ Formen dieser NTS₁R-PET-Liganden (Rezeptoraffinität, Plasmastabilität, synthetische Zugänglichkeit) wurden ⁶⁸Ga-markierte Analoga der besten Kandidaten in Kooperation mit der Abteilung für Nuklearmedizin am Universitätsklinikum Regensburg hergestellt. UR-LS130 (4.56) zeigte eine hohe NTS₁R-Affinität (Ki = 1.2 nM) kombiniert mit exzellenter in vitro-Stabilität in humanem Plasma (t1/2 > 24 h), und das radioaktiv markierte Analogon [⁶⁸Ga]4.56 zeigte eine spezifische Anreicherung in HT-29-Tumoren mit einem Tumor/Muskel-Verhältnis von 16 nach 45 min p.i. in Biodistributions- und PET-Studien an Tumor-Mäusen. Bemerkenswerterweise wies [⁶⁸Ga]4.56 auch eine hohe in vivo-Stabilität auf, was auf den Ersatz von Tyr¹¹ durch β,β-dimethyliertes Tyrosin zurückzuführen ist.
Insgesamt wurden zwei hoch-affine NTS₁R-PET-Liganden fürs Tumor-Imaging mit vielversprechender in vivo-Performance entwickelt. Der festgestellte stabilisierende Effekt des β,β-dimethylierten Tyrosins in Position 11 der Peptid-Grundstruktur, welcher die NTS₁R-Affinität nicht beeinträchtigt, wird nützlich sein für die künftige Entwicklung von Tracern für das Tumor-Imaging, die abgeleitet sind von NT(8-13).
Ein zweites Projekt dieser Arbeit befasste sich mit fluorierten potentiellen PET-Liganden für den CXCR4. Dieser G Protein-gekoppelte Chemokin-Rezeptor ist in verschiedenen Tumoren, u.a. dem Prostata- und dem Mammakarzinom, überexprimiert. „Kalte“ Formen von CXCR4-PET-Liganden, die abgeleitet sind von dem beschriebenen peptidischen CXCR4-Antagonisten FC131, wurden unter Ersatz von Arg durch Amino-funktionalisiertes, Nω-carbamoyliertes Arginin, darauffolgende Alkin-Funktionalisierung und die Anknüpfung an das zuvor genannte Fluoro-Glukosylazid hergestellt. Untersuchungen bezüglich der antagonistischen Aktivität am CXCR4 und der in vitro-Plasmastabilitäten der Liganden ergaben, dass Verbindung 5.24, mit einem pKb-Wert von 7.15 und einer Plasma-Halbwertszeit von > 24 h, als Leitstruktur für die künftige Entwicklung von optimierten fluorierten CXCR4-PET-Liganden fungieren kann.
Metadata last modified: 24 Jan 2024 08:06
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