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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-537382
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.53738
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 20 Februar 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Tag der Prüfung: | 24 Januar 2023 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Stichwörter / Keywords: | Upconversion Nanoparticles, Surface Engineering, Toxicity, GPCR, Photodynamic Therapy |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 53738 |
Zusammenfassung (Englisch)
This thesis demonstrated the importance of surface protecting ligands for the preparation of upconverting nanoparticles (UCNPs) with high brightness, colloidal and chemical stability, biocompatibility, and efficient biomolecule functionalization for cellular uptake or targeting a receptor. The surface protection abilities of different ligands were analyzed with UCNPs of 12 nm diameter as these ...
Zusammenfassung (Englisch)
This thesis demonstrated the importance of surface protecting ligands for the preparation of upconverting nanoparticles (UCNPs) with high brightness, colloidal and chemical stability, biocompatibility, and efficient biomolecule functionalization for cellular uptake or targeting a receptor.
The surface protection abilities of different ligands were analyzed with UCNPs of 12 nm diameter as these are very sensitive towards luminescence quenching effects at the particle surface when suspended in water. The UCNPs were modified by ligand exchange or ligand addition strategies with poly(acrylic acid) (PAA), amphiphilic polymer (AP), and a biomimetic phospholipid membrane coating (PLM). The PLM is the only coating, which provides an efficient hydrophobic barrier against water quenching and particle dissolution. In contrast to UCNPs@PAA and UCNPs@AP, the UCNPs@PLM showed a seven times more intense upconversion luminescence in aqueous media and colloidal stability in a much wider range of solutions, including phosphate buffer as well as solutions of high ionic strength, a wide pH range, and complex cell culture medium. UCNPs@PLM turned out to be suitable for biosensing applications in cells and tissues under serum-free conditions and in serum-supplemented media, while UCNPs@AP were only stable in serum-containing media and UCNPs@PAA were not suitable for in vitro experiments at all.
The importance of surface-shielding ligands on the biocompatibility of UCNPs was demonstrated by UCNPs with the intrinsically non-toxic bilayer coatings AP and PLM in contact to non-transformed epithelial kidney cells (NRK). The chemically stable UCNPs@PLM had no toxic effect on the mammalian model cell line although these particles were efficiently internalized via macropinocytosis and clathrin-dependent pathways. In contrast, the viability and morphology of the cells changed upon uptake of UCNPs@AP with their low chemical stability. UCNPs@AP induced cell swelling and cell death after around 30 h with an EC50 value of (45 ± 7) µg·mL 1 in L 15 (5% FCS) and (15 ± 2) µg·mL 1 in DPBS+- (5% FCS) even though their internalization was ~3 times less efficient compared to non-toxic UCNPs@PLM.
The impact of UCNPs on cell physiology, metabolism, and morphology changes was analyzed in more detail with the poorly shielded medium sized UCNPs@AP with a diameter of 25 nm. The UCNPs@AP interfered strongly with cell adhesion (EC50 of (28 ± 6) µg·mL 1) and migration within < 8 h (EC50 of (4 – 11) µg·mL 1). Resting cells were less sensitive to the particles showing onset of cell death only after ~30 h (EC50 of (17 ± 15) µg·mL 1) and reduction of metabolism after 72 h (EC50 of (103 ± 8) µg·mL 1). It was observed that the cell age had a significant impact on the outcome of the toxicity experiments. The detailed analysis of the impedance profiles with transient cell swelling and the very late reduction of metabolic activity argued against apoptosis and indicated a necrotic cell death. The observed dissolution of the UCNPs@AP in H2O, their cytotoxicity, and the cell response profile supported the hypothesized toxicity pathway of poorly shielded UCNPs: ion leakage within the vesicles, REPO4 formation with phosphates of vesicle membrane, lysosomal damage, followed by necrosis. These studies revealed potential toxic pathways of poorly shielded UCNPs in contact to a non-transformed cell line.
The suitability of several UCNPs surface modifications (Lys, AP, PLM) for functionalization and subsequent cellular uptake by NRK cells was analyzed with the photosensitizer rose bengal (RB). UCNPs@Lys with a monolayer-like particle coating had the lowest RB binding efficiency and a non-detectable RB transport into NRK cells. Nevertheless, UCNPs@Lys-RB induced cell stress. RB was strongly attached to bilayer coated UCNPs@AP, were internalized in higher amounts by the cells and initiated cell death. In contrast, binding of RB and its transport into the cells was highly efficient by bilayer coated UCNPs@PLM without triggering any cell response. The amount of RB uptake by bilayer coated UCNPs was sufficient for the light-induced generation of reactive oxygen species at levels, high enough to initiate cell death. The UCNPs@PLM are considered as promising drug carrier for efficient transport into cells and light-activated therapy.
The potential of UCNPs@PLM as label and carrier for GPCR agonists (here: neurotensin-derivative NT(8-13)) was analyzed for two different cell lines expressing the model GPCR hNTS1R. UCNPs with linker-bound alkyne-NT(8-13) (click-NT-UCNPs) and/or with electrostatically attached alkyne-NT(8-13) (naked-NT-UCNPs) had a high receptor affinity and provoked the characteristic impedance pattern upon hNTS1R activation. Reduced receptor activation in presence of an antagonist confirmed their successful binding by the functionalized particles. The separation of electrostatically bound NT(8 13) from the particle before receptor binding was hypothesized and supported by microscopy studies. This concept was substantiated as BSA was likely to replace partly electrostatically bound alkyne-NT(8 13) from the particle. Serum proteins could neither form a dense protein corona around the particles, hindering receptor activation, nor degrade the particle-attached agonist proteolytically. In conclusion, UCNPs@PLM can be considered as protective carriers for drugs with extracellular targets as for instance, cell surface receptors.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit zeigt die Bedeutung von oberflächenschützenden Liganden für die Herstellung aufkonvertierender Nanopartikel (UCNPs) mit hoher Helligkeit, kolloidaler und chemischer Stabilität, Biokompatibilität und effizienter Anbindung von Biomolekülen für deren Aufnahme in tierische Zellen und die Stimulation von Zelloberflächenrezeptoren. Die oberflächenschützenden Eigenschaften ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit zeigt die Bedeutung von oberflächenschützenden Liganden für die Herstellung aufkonvertierender Nanopartikel (UCNPs) mit hoher Helligkeit, kolloidaler und chemischer Stabilität, Biokompatibilität und effizienter Anbindung von Biomolekülen für deren Aufnahme in tierische Zellen und die Stimulation von Zelloberflächenrezeptoren.
Die oberflächenschützenden Eigenschaften unterschiedlicher Liganden wurden mit 12 nm großen UCNPs analysiert, welche starke Lumineszenzlöschung an der Partikeloberfläche zeigten. Die Partikel wurden über Ligandenaustausch oder durch das Hinzufügen einer zusätzlichen Ligandenschicht aus Polyacrylsäure (PAA), einem amphiphilen Polymer (AP) oder einer biomimetischen Phospholipidmembran (PLM) modifiziert. PLM ist die einzige Modifizierung, die eine hydrophobe Barriere gegen Wassermoleküle, welche Lumineszenz löschen und Partikelauflösung initiieren können, bildet. Im Vergleich zu PAA- und AP-umhüllte Nanopartikel weisen PLM-ummantelte Partikel eine siebenfach höhere Lumineszenz in wässrigen Medien auf. Außerdem sind diese in einer Vielfalt an Lösungsmitteln kolloidal stabil, was für Nanopartikel oftmals herausfordernd ist, wie z.B. in Lösungen mit hoher Ionenstärke, in Phosphatpuffer, in extremen pH Werten und in komplexen Zellkulturmedium. PLM modifizierte Nanopartikel stellten sich als geeignet heraus für zelluläre Anwendungen in FCS freien und FCS-supplementierten Medien, wohingegen AP ummantelte Partikel nur in FCS-haltigen Medien stabil und PAA umhüllte Partikel unter diesen Bedingungen gar nicht für in vitro Experimente geeignet waren.
Die Wichtigkeit von oberflächenschützenden Liganden für die Biokompatibilität von UCNPs wurde anhand der intrinsisch nicht toxischen Liganden AP und PLM an nicht-transformierten Epithelzellen demonstriert. Die chemisch stabilen PLM umhüllten Partikel zeigten keine toxische Wirkung in der Säugetiermodelzelllinie, obwohl sie in großen Mengen über Makropinozytose und Clathrin-abhängige Wege internalisiert wurden. Im Gegensatz dazu veränderte sich die Viabilität und die Morphologie der Zellen nach Exposition zu AP modifizierten Partikeln mit geringer chemischer Stabilität. AP ummantelte Partikel erzeugten ein Anschwellen der Zellen und induzierten deren Tod nach etwa 30 h mit EC50 Werten von (45 ± 7) µg·mL 1 in L 15 Medium (5% FCS) und von (15 ± 2) µg·mL 1 in DPBS+- (5% FCS), obwohl diese Partikelsorte dreifach weniger effizient aufgenommen wurde als die nicht toxischen PLM umhüllten Partikel.
Der Einfluss aufkonvertierender Nanopartikel auf die Funktionstüchtigkeit der Zellen, den Metabolismus und die Morphologie wurde im Detail mit den wenig schützenden AP umhüllten Partikeln in mittlerer Größe gezeigt. Diese Partikel schränkten die aktiven Zellen stark in ihrer Adhäsions- (EC50 von (28 ± 6) µg·mL 1) und Migrationsfähigkeit innerhalb weniger als 8 h ein (EC50 von (4 – 11) µg·mL 1). Der Partikel-induzierte Zelltod von Zellen in der Ruhephase fand nach ca. 30 h (EC50 of (17 ± 15) µg·mL 1) statt. Eine Verringerung der metabolischen Aktivität konnte nach 72 h (103 ± 8) µg·mL 1) festgestellt werden. Es wurde beobachtet, dass das Alter der Zellen einen signifikanten Einfluss auf die Ergebnisse der Toxizitätsexperimente hatte. Die detaillierte Analyse des Zellantwortprofils mit dem vorübergehenden Anschwellen der Zellen und der spät eintretenden Reduzierung der metabolischen Aktivität sprechen gegen Apoptose und für einen nekrotischen Zelltod. Die beobachtete Auflösung der Partikel in zell-freien Experimenten, deren Toxizität und das Zellantwortprofil unterstützten die aufgestellte Hypothese zum Toxizitätsweg von wenig geschützten aufkonvertierenden Nanopartikeln: Austreten von Ionen in Vesikeln, Ausbildung von REPO4 mit den Phosphatgruppen der Vesikelmembran, Beschädigung der Lysosomen und darauffolgende Nekrose. Diese Studien zeigten die potenziellen Toxizitätswege von wenig geschützten, AP ummantelten UCNPs in nicht-transformierten Zelllinien.
Die Eignung unterschiedlicher Oberflächenmodifizierungen für aufkonvertierende Nanopartikel (Lysin (Lys), AP, PLM) zur Funktionalisierung und für deren Aufnahme in tierische Zellen wurde mit dem Photosensibilisator Rose Bengal (RB) an einer Säugetiermodellzelllinie untersucht. Nanopartikel, welche mit dem Monoschicht ausbildenden Liganden Lys modifiziert wurden, zeigten die geringste Anbindungseffizienz von RB und einen nicht nachweisbaren RB Transport in die Zellen. Trotzdem induzierten diese Partikel Stress in den Zellen. Im Gegensatz dazu konnte RB in großen Mengen an den Doppelschichten ausbildenden Liganden AP gebunden und von den Zellen aufgenommen werden. Diese Partikel initiierten den Zelltod. Die Anbindung und der Transport von RB in die Zellen war höchst effizient mit Partikeln mit Phospholipiddoppelschicht (PLM), ohne dabei eine toxische Zellantwort hervorzurufen. Die Mengen an intrazellulärem RB war bei den Liganden, die Doppelschichten ausbildeten, ausreichend, um Licht-induzierte reaktive Sauerstoffspezies in Konzentrationen zu erzeugen, die hoch genug waren, um den Zelltod auszulösen. Aufgrund dieser Ergebnisse könnten die PLM modifizierten Partikeln vielversprechende Transporter für pharmakologische Wirkstoffe sein, um deren effizienten Transport in Zellen und darüber hinaus eine Licht-aktivierte Therapie zu ermöglichen.
Das Potential von PLM ummantelten Partikeln als Label und Transporter für G Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) Agonisten (hier: ein Neurotensinderivat NT(8-13)) wurde mit zwei verschiedenen Zelllinien untersucht, die den humanen Neurotensin 1 Rezeptor (hNTS1R) exprimieren. Nanopartikel mit Linker gebundenem Alkin-NT(8-13) (click-NT-UCNPs) und/oder elektrostatisch gebundenem Alkin-NT(8-13) (naked-NT-UCNPs) hatten eine hohe Affinität zum Rezeptor und lösten das charakteristische Impedanz Profil nach Aktivierung des hNTS1R in den Zellen aus. Die reduzierte Fähigkeit, den Rezeptor in Anwesenheit eines Antagonisten zu aktivieren, bestätigte die spezifische Rezeptoraktivierung durch die funktionalisierten Partikel. Eine potentielle Trennung des elektrostatisch gebundenem NT(8-13) vom Partikel nach Rezeptorbindung wurde postuliert und unterstützt durch Mikroskopie Studien, die keine naked-NT-UCNPs, allerdings click-NT-UCNPs in großer Anzahl an der Zelloberfläche zeigten. Diese Theorie wurde weiter verifiziert, da es so schien als würde Serumalbumin teilweise elektrostatisch gebundenes Alkin-NT(8-13) vom Partikel verdrängen. Serumproteine formten weder eine dichte Proteincorona um die Partikel, was die Rezeptoraktivierung verhindern hätte können, noch konnten sie den partikelgebundenen Agonist proteolytisch abbauen. Zusammenfassend können PLM modifizierte Partikel als schützende Transporter für pharmakologische Wirkstoffe mit extrazellulären Targets, wie z.B. Rezeptoren an der Zelloberfläche, betrachtet werden.
Metadaten zuletzt geändert: 20 Feb 2023 13:14
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