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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-544998
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.54499
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 21 Juli 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Philipp Beckhove |
| Tag der Prüfung: | 28 Juni 2023 |
| Institutionen: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Melanoma, Immunotherapy, MITF, Immune resistance |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 54499 |
Zusammenfassung (Englisch)
Immunotherapy with immune checkpoint inhibitors has largely improved survival of melanoma patients. However, many patients still do not benefit from so far developed strategies due to primary or acquired resistance. In malignant melanoma, increased immune resistance is associated with the downregulation of Microphtalmia-associated transcription factor (MITF). MITF is a key regulator of melanocyte ...
Zusammenfassung (Englisch)
Immunotherapy with immune checkpoint inhibitors has largely improved survival of melanoma patients. However, many patients still do not benefit from so far developed strategies due to primary or acquired resistance. In malignant melanoma, increased immune resistance is associated with the downregulation of Microphtalmia-associated transcription factor (MITF). MITF is a key regulator of melanocyte proliferation and survival. In melanoma cells its decrease results in a dedifferentiated phenotype which is concomitant with invasiveness and therapy resistance.
The aim of this work was to identify mechanisms of immune resistance in MITFlow human melanoma cells. In order to discover genes that confer immune resistance in MITFlow melanomas, I performed a functional high-throughput (HTP) RNAi screen targeting 5202 genes in two melanoma cell lines derived from one immunotherapy refractory melanoma patient. One of these cell lines, Ma-Mel-86a expressed low levels of MITF while the other, Ma-Mel-86c expressed high MITF levels. The use of both cell lines allowed for the discrimination of common and differential effects of the genes in the MITFlow and MITFhigh melanoma cell lines. 91 genes that caused a tumor cell intrinsic resistance against the attack by cytotoxic T cells were identified by this screen and confirmed in secondary validation experiments.
The in vitro work was paralleled by extensive bioinformatic analyses using public bulk and single cell RNA-Seq data sets of melanoma samples or patient-derived melanoma cell lines. Immune resistance (IR) genes were shown to be co-expressed in gene expression clusters. IR genes and gene clusters showed heterogeneous expression patterns between patients but homogeneous expression within individual patients and certain genes and clusters could be correlated to a low MITF expression. Furthermore, IR genes were differentially expressed between melanoma cells and healthy cells within the melanoma stroma, and between MITFlow and MITFhigh melanoma cells. Interestingly, MITFlow cells still shared features with MITFhigh cells, but additionally with immunosuppressive cancer-associated fibroblasts.
Several IR genes (TMCC3, SLC39A13, MOK and ZNF443) with a particular strong immune resistance potential that were mostly differentially expressed in MITFlow melanomas were selected for further functional assessment. These analyses revealed a protective role of these genes against apoptosis induction through stimulation by T cell derived cytotoxic ligands such as TRAIL, TNFα or IFNγ. I performed extensive mode of action analyses for two IR genes, Transmembrane and coiled-coil domain family 3 (TMCC3) and Solute carrier family 39 member 13 (SLC39A13) to uncover their mechanisms to convey resistance in the MITFlow cell line Ma-Mel-86a. TMCC3 which is located in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) protects MITFlow melanoma cells against ER stress and ensures apoptosis resistance by increasing the expression of anti-apoptotic molecules, especially of those involved in death receptor signaling such as CFLAR and BCL-2. Upon treatment with death receptor ligand TRAIL to which Ma-Mel-86a showed primary resistance, apoptosis is executed in TMCC3 deficient cells. SLC39A13/ZIP13 is a zinc transporter located in the Golgi apparatus that protects MITFlow cells against IFNγ-mediated apoptosis. SLC39A13/ZIP13 controls STAT1 and IFNγR1 expression and induces the expression of anti-apoptotic BCL-2, making the cells resistant against IFNγ-mediated lysis.
In conclusion, I identified a variety of so far unknown immune resistance genes in immunotherapy refractory MITFlow melanoma cells that regulate T cell and cytotoxic ligand-mediated rejection which may represent novel targets for future immunotherapeutic interventions in malignant melanoma.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Einsatz von Immuncheckpoint-Inhibitoren in Immuntherapien hat das Überleben von Hautkrebs-patient:innen stark verbessert. Viele Patient:innen profitieren allerdings nicht von bisher entwickelten Strategien aufgrund von primären oder erworbenen Resistenzmechanismen. Im malignen Melanom steht eine erhöhte Resistenz im Zusammenhang mit der verminderten Expression von Microphtalmia-associated ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Einsatz von Immuncheckpoint-Inhibitoren in Immuntherapien hat das Überleben von Hautkrebs-patient:innen stark verbessert. Viele Patient:innen profitieren allerdings nicht von bisher entwickelten Strategien aufgrund von primären oder erworbenen Resistenzmechanismen. Im malignen Melanom steht eine erhöhte Resistenz im Zusammenhang mit der verminderten Expression von Microphtalmia-associated transcription factor (MITF). MITF ist der Haupttranskriptionsfaktor in Melanozyten und wichtig für die Proliferation und das Überleben der Zellen. In Melanomzellen ist eine Abnahme von MITF mit einem de-differenzierten Phänotyp verbunden, einhergehend mit erhöhter Zellinvasion und Therapieresistenz.
Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Immunresistenzmechanismen in humanen Melanom-zellen mit geringer MITF-Expression (MITFlow). Um Gene zu identifizieren, welche Immunresistenz in MITFlow-Melanomen vermitteln, habe ich ein funktionelles Hochdurchsatzscreening auf Basis von RNA-Interferenz durchgeführt, bei dem 5202 Gene in zwei Melanomzelllinien getestet wurden, welche aus einem Immuntherapie-refraktären Patienten generiert wurden. Eine der Zelllinien, Ma-Mel-86a, exprimierte geringe Level von MITF (MITFlow), während die andere, Ma-Mel-86c, hohe Level von MITF exprimierte (MITFhigh). Durch die Verwendung beider Zelllinien konnten gemeinsame und differenzielle Effekte der getesteten Gene zwischen den MITFlow- und MITFhigh-Melanomzelllinien unterschieden werden. 91 Gene, welche intrinsische Resistenz gegenüber der Attacke zytotoxischer T-Zellen verursachten, konnten in diesem Screening identifiziert und in weiteren Validierungsexperimenten bestätigt werden.
Parallel wurden umfassende bioinformatische Analysen mithilfe von öffentlichen Bulk- und Einzelzell-RNA-Seq-Datensätzen von Melanomproben oder Melanomzelllinien, welche aus Patient:innen-material gewonnen werden konnten, durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Immunresistenz (IR)-Gene in Genexpressionsclustern ko-exprimiert sind. IR-Gene und -Cluster zeigten heterogene Expressionsmuster zwischen Patient:innen, jedoch homogene Expressionen innerhalb individueller Patient:innen. Zusätzlich konnten bestimmte Gene und Cluster mit geringer MITF-Expression korreliert werden. IR-Gene waren außerdem sowohl zwischen Melanomzellen und gesunden Zellen innerhalb des Melanomstromas als auch zwischen MITFlow- und MITFhigh-Melanomzellen differenziell exprimiert. Interessanterweise zeigten MITFlow-Zellen einige Merkmale von MITFhigh-Zellen, jedoch zusätzlich welche von immunsuppressiven Krebs-assoziierten Fibroblasten.
Mehrere Gene (TMCC3, SLC39A13, MOK und ZNF443) mit ausgeprägtem IR-Potential, welche zumeist differenziell in MITFlow-Zellen exprimiert waren, wurden für weitere funktionelle Analysen ausgewählt. Hier zeigte sich eine protektive Rolle der Gene gegenüber der Induktion von Apoptose durch die Stimulation mit zytotoxischen T-Zell-Liganden wie TRAIL, TNFα oder IFNγ. Umfassendere Analysen zur Wirkungsweise der beiden Gene Transmembrane and coiled-coil domain family 3 (TMCC3) und Solute carrier family 39 member 13 (SLC39A13) wurden durchgeführt, um die genauen Mechanismen des Resistenzcharakters der MITFlow-Zelllinie Ma-Mel-86a aufzuschlüsseln. TMCC3 ist in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER) lokalisiert und schützt MITFlow-Zellen vor ER-Stress. Es stellt die Resistenz gegenüber Apoptose sicher, indem anti-apoptotische Moleküle induziert werden - vor allem jene, welche in Todesrezeptorsignalwegen involviert sind wie CFLAR und BCL-2. Bei Behandlung mit dem Todesrezeptorliganden TRAIL, gegenüber welchem Ma-Mel-86a eine primäre Resistenz zeigt, wird die Apoptose in TMCC3-defizienten Zellen ausgelöst. SLC39A13/ZIP13 ist ein Zinktransporter, welcher im Golgi-Apparat lokalisiert ist, und schützt MITFlow-Zellen vor IFNγ-vermittelter Apoptose. SLC39A13/ZIP13 kontrolliert die Expression von STAT1 und IFNγR1 und induziert die Expression von anti-apoptotischem BCL-2, wodurch die Zellen resistent gegenüber IFNγ-vermittelter Lyse werden.
Zusammenfassend habe ich eine Auswahl bisher unbekannter Immunresistenzgene in Immuntherapie-refraktären MITFlow-Melanomzellen identifiziert, welche den Zelltod durch T-Zellen und zytotoxische Liganden regulieren und welche als neue Angriffspunkte in künftigen immuntherapeutischen Interventionen im malignen Melanom dienen könnten.
Metadaten zuletzt geändert: 21 Jul 2023 07:30
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