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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-547974
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.54797
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 13 Oktober 2023 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Tag der Prüfung: | 27 September 2023 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Stichwörter / Keywords: | Enzyme evolution, Histidinol phosphate phosphatase, directed evolution, ancestral sequence reconstruction, functional annotation, alanine scan, haloacid dehalogenase superfamily |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 54797 |
Zusammenfassung (Englisch)
The elaborate metabolism of modern organisms raises the question of how such a complex system could have developed from a simple ancient prestage with a presumably very limited repertoire of enzymes. To answer this question various models have been put forward. A popular model assumes that the promiscuous side activities of enzymes represent a starting point for new reactions and reaction ...
Zusammenfassung (Englisch)
The elaborate metabolism of modern organisms raises the question of how such a complex system could have developed from a simple ancient prestage with a presumably very limited repertoire of enzymes. To answer this question various models have been put forward. A popular model assumes that the promiscuous side activities of enzymes represent a starting point for new reactions and reaction sequences from which novel enzymes can develop through gene duplication and divergent evolution. A remnant of these duplication events are the superfamilies of related enzymes, which have the same fold and may also have functional similarities but can often catalyze different reactions or catalyze the same type of reaction on different substrates. One of the most widespread superfamilies is the so-called
haloacid dehalogenase (HAD) superfamily which mainly consists of phosphatases and phosphonatases that act on a wide variety of substrates. Substrate specificity is mainly achieved by highly variable cap modules which are inserted into a core Rossmann fold and cover the active site, both enabling specific interactions with the substrate and shielding the reaction center from bulk solvent. Due to the wide distribution of the HAD superfamily, it is assumed that it represents one of the oldest superfamilies. It is further assumed that various enzymes from the HAD superfamily that differed from each other by the
aforementioned caps were already present in the last common ancestor of all cellular organisms (LUCA). A HAD enzyme with a comparatively original fold is the histidinol phosphate phosphatase (HolPase) from Escherichia coli (ecHisB-N). The HolPase is part of histidine biosynthesis, where it catalyzes the penultimate step, namely the dephosphorylation of histidinol phosphate to histidinol. Although this pathway is identical in all histidine-synthesizing species, which is why it is assumed that it was already present in LUCA, the HolPases of different species differ significantly and so far, HolPases from three different superfamilies have been identified. All the other enzymes from histidine biosynthesis are however conserved across different species, which means that the HolPases are probably evolutionary younger than the other enzymes of this pathway. This observation raises several questions, which are addressed in the present work. In the first part, the question regarding the evolutionary origin of ecHisB-N was raised. The fact that this enzyme is not conserved in histidine-synthesizing species, while belonging to a very old protein superfamily, indicates that ecHisB-N evolved from a more ancestral enzyme, possibly a primordial phosphatase. In previous work, it has been argued that ecHisB-N and its closest homologue D-glycero-D-manno-heptose-1,7-bisphosphat-7-phosphatase (GmhB) were derived from the same promiscuous phosphatase. GmhB variants catalyze the hydrolysis of the two anomers of D-glycero-D-manno-heptose-1,7-bisphosphat (αHBP or βHBP), with one anomer usually being highly preferred by αGmhB or βGmhB, respectively. We found that ecHisB-N shows promiscuous activity for βHBP but not for αHBP, while the βGmhB from Crassaminicella sp. showed a promiscuous activity for HolP. Consistent with this, in a combined phylogenetic tree of αGmhB, βGmhB, and HisB-N sequences, HisB-N sequences formed a compact subcluster derived from βGmhBs. To analyze the properties of the precursors, several enzymes were resurrected by ancestral sequence reconstruction, and their functionality was tested in vitro. In this analysis, a promiscuous HolPase activity could already be detected in the ancestral enzymes belonging to nodes that predate the functional divergence of βGmhB and HisB-N. This HolPase activity was significantly increased in enzymes that belong to younger nodes and from which only modern HisB-N enzymes are derived. This increase in the catalytic efficiency of HolP turnover is reflected in the shape and electrostatics of the active site as predicted by AlphaFold. Finally, a revised model for the evolution of HisB-N from an ancestral βGmhB was developed with the help of a detailed analysis of the phylogenetic tree. In agreement with the experimental data, a horizontal gene transfer of a promiscuous βGmhB enzyme from an ancestral δ-Proteobacterium to an ancestral γ-Proteobacterium is assumed. After the horizontal gene transfer, this βGmhB then most likely evolved into a modern HisB-N.In the second and third part, the question is asked whether there are other HolPases that are not directly related to HolPases which were reported so far and instead developed independently. Specifically, in the second part, a protein of the HAD superfamily from Pseudomonas aeruginosa
(paHisN) is analyzed, for which a HolPase function was suggested on the basis of in vivo experiments that were reported in a recent publication. An analysis of the AlphaFold-predicted structure of paHisN in the present work confirmed its classification as a member of the HAD superfamily. A comparison to the HAD family HolPase ecHisB-N unveiled that the two structures differed significantly in their cap structures, indicating that paHisN was not derived from ecHisB-N or vice versa. Instead, paHisN showed considerable similarities to hosphoserine phosphatases (PSPases) both at the sequence level and regarding the protein fold, indicating a possible evolutionary relationship or overlapping functions.
Subsequent characterization of the enzyme in vitro showed that the protein is present as a monomer in aqueous solution and has a melting temperature of 46°C. In addition, the assumed HolPase activity could be confirmed as the native function of this enzyme. Moreover, a promiscuous PSPase activity was
discovered which supports the hypothesis of a distant relationship to this class of enzymes. To distinguish HolPases from PSPases among the homologues of paHisN, an alanine scan of the active site was performed to identify residues critical to HolPase function. The results of this alanine scan were used in combination with a sequence logo of PSPases to derive a fingerprint, consisting of a DxD motif and a tyrosine, which is assumed to be conclusive for a HolPase function. The subsequent analysis of a sequence similarity network (SSN) of homologous proteins led to the identification of numerous non-annotated proteins in β- and γ-Proteobacteria which contained this fingerprint. The conservation of this set of critical residues suggests, that these homologues are HolPases with similar properties as paHisN. This conclusion was cross-validated by a bioinformatic analysis of the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database which showed that for many β- and -Proteobacteria there was indeed no HolPase annotated. This finding supports the proposed annotation of the homologues as HolPases most likely identifying the last missing enzyme from histidine biosynthesis in these organisms. An additional bioinformatic analysis of all phyla revealed that there generally is a considerable knowledge-gap concerning the HolPase function as for 32 % of all histidine-synthesizing organisms the enzyme that catalyzes the HolPase reaction is not known. In archaea this knowledge-gap is especially
pronounced as in this domain an annotated HolPase is missing in approximately two thirds of the histidine-synthesizing species. The third part is therefore dedicated to the search for the enzyme that catalyzes the HolPase reaction in the archaeal kingdom. In previous work, a gene between hisC and hisB that was annotated as a putative phosphatase from the HAD superfamily had been noticed in the archaeon Nitrosopumilus maritimus. The location of this gene within a cluster of genes from histidine biosynthesis and classification of its gene product as HAD protein made this a promising candidate for the missing HolPase. An analysis of sequence and the AlphaFold-predicted structure in the course of this work confirmed that this protein
belongs to the HAD superfamily. However, the cap of this protein showed no similarity to the caps of either paHisN or ecHisB-N, indicating that all three proteins evolved independently. The comparison to a third HolPase from the HAD superfamily which was recently discovered in the archaeon
Thermococcus onnurineus uncovered a limited sequence identity of 23.9% and a moderate similarity in the protein fold. While this indicated a distant relationship of the two proteins, the similarities were too low to infer a HolPase function for the protein from N. maritimus. Therefore, an in vitro characterization of the uncharacterized protein from N. maritimus was conducted which confirmed the suspected HolPase activity and showed that the protein exists as a monomer in aqueous solution and has a melting
temperature of 37°C. In accordance to previously used nomenclature, nmHisN is therefore proposed as name for the protein from N. maritimus. The observed HolPase function of nmHisN, in combination with the distant relationship to the HolPase from T. onnurineus, suggested that these two proteins might
be representative for a new class of significantly diverged HolPases which is widely distributed within the archaeal kingdom. To test this hypothesis, a fingerprint of HolPase defining residues was established
on the basis of an alanine scan of the active site of nmHisN, which should allow for the identification of other archaeal HolPases. This fingerprint consisting of a DY motif, a lysine and a glutamate, which are assumed to be conclusive for a HolPase function of homologues of nmHisN. Afterwards, an SSN was
created in which homologues of nmHisN were found in a wide variety of archaeal phyla. The homologues of two phyla, namely the Thaumarchaeota and the candidate phylum of Bathyarchaeota, contained a highly conserved fingerprint, strongly indicating that these proteins are HolPases. Moreover,
homologues which contained three of the four fingerprint residues were identified in Euryarchaeota and, interestingly, also in bacterial δ-Proteobacteria. This indicates that these proteins also possess HolPase function. Taken together, the results of this part show that the HolPases from N. maritimus and T. onnurineus constitute a third type of HolPase from the HAD superfamily besides paHisN and ecHisB-N. This type of HolPase seems to be widely distributed among archaea which indicates its ancient history. The proposed annotation of these proteins as HolPases also helps to close this knowledge gap on the histidine biosynthesis of archaea. The fourth part of the work deals with functional transitions and the general evolvability of the HAD superfamily. Specifically, a possible functional transition from a PSPase to a HolPase was analyzed, as suggested in the case of the evolution of paHisN. For this, the E. coli PSPase ecSerB served as a model enzyme, which showed no measurable HolPase function in vitro. Several active site amino acids were randomized simultaneously and then tested for their ability to mediate growth of a ΔholPase strain on selective medium lacking histidine. After one round of random mutagenesis and selection, two enzyme variants were identified that exhibited continuously measurable HolPase activity in vitro with a catalytic efficiency of 1.7 M-1s-1 and 7.8 M-1s-1, respectively. In addition, the general evolvability of HAD enzymes was investigated using the promiscuous PSPase activity of ecHisB-N as case study. In previous work, directed evolution improved the promiscuous PSPase activity by about an order of magnitude. In this work, the activity could be increased by another order of magnitude by further random mutagenesis and selection. Here, D58 was identified as a key residue where mutation to asparagine alone resulted in a 60-fold improvement in PSPase activity. Both lines of experiment underscore the functional versatility
of the HAD superfamily which can be easily evolved to new substrates through adaptations in the variable caps, while the basic catalytic machinery is preserved. Finally, based on the experimental data, a three-step model for the evolution of HolPases was proposed. It is assumed that HolP is hydrolyzed at a slow rate spontaneously in absence of an enzyme, mediated e.g., by Mg2+. It is furthermore assumed, that during the assembly of the histidine biosynthetic pathway the HolPase function was under the lowest selection pressure. The lack of conservation within the HolPases furthermore indicates that LUCA did not yet have a specialized HolPase. In the second step of evolution, with increasing genome size, the existence of one or more phosphatases with promiscuous
HolPase activity became likely. However, specialized HolPases were most probably only established in a third step, after the three different kingdoms of life had diverged. After that, several horizontal gene transfers probably occurred, which is why homologous HolPases are now found in very distantly related organisms.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der ausgefeilte Stoffwechsel moderner Organismen wirft die Frage auf, wie sich ein so komplexes System aus einfachen Vorstufen mit einem mutmaßlich sehr begrenzten Repertoire von Enzymen entwickeln konnte. Um diese Frage zu beantworten, wurden verschiedene Modelle entwickelt. Ein populäres Modell geht davon aus, dass promiskuitive Nebenreaktionen von Enzymen einen Ausgangspunkt für neue ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der ausgefeilte Stoffwechsel moderner Organismen wirft die Frage auf, wie sich ein so komplexes System aus einfachen Vorstufen mit einem mutmaßlich sehr begrenzten Repertoire von Enzymen entwickeln konnte. Um diese Frage zu beantworten, wurden verschiedene Modelle entwickelt. Ein populäres Modell geht davon aus, dass promiskuitive Nebenreaktionen von Enzymen einen
Ausgangspunkt für neue Reaktionen und Reaktionssequenzen darstellen, aus dem sich durch Genduplikation und divergente Evolution neuartige Enzyme entwickeln können. Ein Relikt dieser Genduplikationen sind demnach die Superfamilien aus verwandten Enzymen, die zwar den gleichen
Faltungstyp besitzen und unter Umständen auch funktionale Ähnlichkeiten aufweisen, aber häufig unterschiedliche Reaktionen katalysieren oder die gleiche Reaktion an unterschiedlichen Substraten katalysieren. Eine der am weitesten verbreiteten Superfamilien ist die sogenannte Haloacid-
Dehalogenase-(HAD)-Superfamilie, die hauptsächlich Phosphatasen und Phosphonatasen beinhaltet, die eine Vielzahl verschiedener Substrate umsetzen. Substratspezifität wird dabei hauptsächlich durch hochvariable sogenannte Caps erreicht, die als Insertion in die Rossmann-Faltung eingefügt sind und das aktive Zentrum bedecken. Diese Caps ermöglichen sowohl spezifische Wechselwirkungen mit dem jeweiligen Substrat als auch eine Abschirmung des Reaktionszentrums vom Lösungsmittel. Wegen der weiten Verbreitung der HAD-Superfamilie geht man davon aus, dass sie eine der ältesten Superfamilien ist. Man geht weiterhin davon aus, dass verschiedene Enzyme der HAD Superfamilie, die sich durch die besagten Caps voneinander unterschieden, schon im letzten gemeinsamen Vorläufer aller zellulären
Organismen (LUCA) vorhanden waren. Ein HAD-Enzym mit einer vergleichsweise ursprünglichen Faltung ist die Histidinolphosphatphosphatase (HolPase) aus Escherichia coli (ecHisB-N). Die HolPase ist Teil der Histidin Biosynthese, in der sie den vorletzten Schritt, nämlich die Dephosphorylierung von Histidinolphosphat zu Histidinol katalysiert. Obwohl dieser Stoffwechselweg in allen Histidinsynthetisierenden Spezies identisch abläuft - weshalb man davon ausgeht, dass er bereits im LUCA etabliert war - unterscheiden sich die HolPasen verschiedener Spezies deutlich voneinander. Bisher wurden HolPasen aus drei verschiedenen Superfamilien identifiziert. Alle anderen Enzyme der Histidin-Biosynthese sind jedoch speziesübergreifend konserviert, was bedeutet, dass die HolPasen vermutlich jünger sind als die anderen Enzyme des Stoffwechselwegs. Diese Sonderstellung der HolPasen führt zu mehreren Fragen, die in der vorliegenden Arbeit adressiert werden. Im ersten Teil wurde der Frage nach dem evolutionären Ursprung von ecHisB-N nachgegangen. Die Tatsache, dass dieses Enzym in Histidin-synthetisierenden Spezies nicht konserviert ist, aber gleichzeitig zu einer sehr alten Protein-Superfamilie gehört, weist darauf hin, dass sich ecHisB-N aus einem ursprünglicheren Enzym, möglicherweise einer urtümlichen Phosphatase, entwickelt hat. In früheren Arbeiten wurde angenommen, dass ecHisB-N und das am nächsten verwandte homologe Enzym D-glycero-D-manno-heptose-1,7-Bisphosphat-7-Phosphatase (GmhB) aus derselben promiskuitiven Phosphatase hervorgegangen sind. GmhB-Varianten katalysieren die Hydrolyse des anomeren D-glycero-D-manno-heptose-1,7-bisphosphats (αHBP oder βHBP), wobei meist ein Anomer stark von αGmhB oder βGmhB bevorzugt wird. Wir konnten herausfinden, dass ecHisB-N promiskuitive Aktivität für βHBP, jedoch nicht für αHBP zeigt, während für βGmhB aus Crassaminicella sp. eine promiskuitive Aktivität für HolP nachgewiesen werden konnte. Übereinstimmend damit bildeten HisB-N Sequenzen in einem kombinierten phylogenetischen Baum aus αGmhB-, βGmhB- und HisB-N Sequenzen, einen kompakten Subcluster, der sich von βGmhBs ableitet. Um die Eigenschaften der Vorläufer zu analysieren, wurden mehrere Enzyme durch anzestrale Sequenzrekonstruktion rekonstruiert und ihre Funktionalität in vitro getestet. In dieser Analyse konnte nachgewiesen werden, dass bereits Enzyme, die zu Knotenpunkten gehörten, die zeitlich vor der funktionellen Divergenz von βGmhB und HisB-N lagen, eine promiskuitive HolPase-Aktivität besaßen.
Diese HolPase Aktivität war in Enzymen, die zu späteren Knotenpunkten gehören und von denen sich ausschließlich heutige HisB-N Enzyme ableiten, nochmal deutlich erhöht. Diese Steigerung der katalytischen Effizienz des HolP Umsatzes spiegelt sich in der von AlphaFold vorhergesagten Form und
Elektrostatik des aktiven Zentrums wider. Abschließend wurde mit Hilfe einer detaillierten Analyse des phylogenetischen Baumes ein überarbeitetes Modell für die Evolution von HisB-N aus einem anzestralen βGmhB entworfen. Im Einklang mit den experimentellen Daten wird von einem horizontalen Gentransfer eines promiskuitiven βGmhB Enzyms von einem anzestralen
δ-Proteobakterium auf ein anzestrales γ-Proteobakterium ausgegangen. Nach dem horizontalen Gentransfer entwickelte sich dieses βGmhB dann höchst-wahrscheinlich zu einem modernen HisB-N. Im zweiten und dritten Teil wird der Frage nachgegangen, ob es noch weitere HolPasen gibt, die nicht
direkt von den bisher beschriebenen HolPasen abstammen, sondern sich stattdessen unabhängig davon entwickelten. Konkret wird im zweiten Teil ein Protein der HAD-Superfamilie aus Pseudomonas aeruginosa (paHisN) analysiert, für das auf Basis von publizierten in vivo Experimenten eine HolPase Funktion
vorgeschlagen wurde. Eine Analyse der von AlphaFold vorhergesagten Struktur von paHisN im Rahmen dieser Arbeit bestätigte die Zugehörigkeit zur HAD-Superfamilie. Ein Vergleich mit der bereits bekannten HolPase aus der HAD-Superfamilie, ecHisB-N, ergab jedoch, dass sich die beiden Strukturen
in ihren Caps deutlich unterschieden, was darauf hinweist, dass weder paHisN von ecHisB-N abgeleitet ist noch umgekehrt ecHisB-N von paHisN. Stattdessen zeigte paHisN sowohl auf Sequenzebene als auch in Bezug auf die Proteinfaltung erhebliche Ähnlichkeiten zu Phosphoserin-Phosphatasen
(PSPasen), was auf eine mögliche evolutionäre Verwandtschaft oder überlappende Funktionen hinweist. Eine anschließende Charakterisierung des Enzyms in vitro zeigte, dass das Protein in wässriger Lösung als Monomer vorliegt und einen Schmelzpunkt von 46°C besitzt. Außerdem konnte die vermutete HolPase-Aktivität als native Funktion des Enzyms bestätigt werden. Darüber hinaus wurde eine promiskuitive PSPase-Aktivität entdeckt, die die Hypothese einer entfernten Verwandtschaft zu PSPasen unterstützt. Um unter den Homologen von paHisN HolPasen und PSPasen unterscheiden zu
können, wurde ein Alanin-Scan des aktiven Zentrums durchgeführt, um die Reste zu identifizieren, die kritisch für die HolPase-Funktion sind. Aus dem Alanin-Scan sowie einem Vergleich mit einem Sequenzlogo von PSPasen wurde ein Fingerabdruck abgeleitet, bestehend aus einem DxD-Motiv und
einem Tyrosin, von dem angenommen wird, dass er ein aussagekräftiger Klassifikator für HolPasen ist. Die anschließende Analyse eines Sequenzähnlichkeitsnetzwerks (SSN) homologer Proteine führte zur
Identifikation zahlreicher nicht annotierter Proteine in β- und γ-Proteobakterien die diesen Fingerabdruck aufwiesen. Die Konserviertheit dieser kritischen Reste legt nahe, dass es sich bei diesen Homologen um HolPasen handelt, die ähnliche Eigenschaften wie paHisN besitzen. Diese
Schlussfolgerung wurde durch eine bioinformatische Analyse der Datenbank Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) validiert, die zeigte, dass für viele β- und γ-Proteobakterien tatsächlich keine HolPase annotiert war. Dieser Befund unterstützt die vorgeschlagene Annotation der Homologen als HolPasen und identifiziert damit wahrscheinlich das letzte fehlende Enzym aus der Histidin-Biosynthese dieser Organismen. Eine zusätzliche bioinformatische Analyse aller Phyla ergab, dass insgesamt eine erhebliche Wissenslücke im Hinblick auf die HolPase-Funktion besteht, da für 32% aller Histidin synthetisierenden Organismen das Enzym, das die HolPase-Reaktion katalysiert nicht bekannt ist. In der Domäne der Archaeen ist diese Lücke besonders ausgeprägt, da hier bei etwa zwei Dritteln der Histidin-synthetisierenden Arten eine annotierte HolPase fehlt. Im dritten Teil der Arbeit ist daher der Suche nach einem Enzym gewidmet, das die HolPase Reaktion in Archaeen katalysiert. In einer früheren Arbeit war im Archaeon Nitrosopumilus maritimus ein Gen
zwischen hisC und hisB aufgefallen, das als putative Phosphatase aus der HAD-Superfamilie annotiert war. Die Lage innerhalb eines Genclusters aus Genen der Histidin-Biosynthese und die Klassifizierung des Genprodukts als HAD-Protein machten es zu einem vielversprechenden Kandidaten für die fehlende
HolPase. Eine Analyse der Sequenz und er von AlphaFold vorhergesagten Struktur im Rahmen der vorliegenden Arbeit bestätigte die Zugehörigkeit zur HAD-Superfamilie. Allerdings zeigte die Cap-Struktur dieses Proteins keine Ähnlichkeit zu den Caps von paHisN oder ecHisB-N, was darauf hindeutet, dass sich alle drei Proteine unabhängig voneinander entwickelten. Der Vergleich mit einer dritten HolPase aus der HAD-Superfamilie, die kürzlich im Archaeon Thermococcus onnurineus entdeckt wurde, ergab eine Sequenzidentität von lediglich 23.9 % und eine moderate Ähnlichkeit in der Proteinfaltung. Dies deutete zwar auf eine entfernte Verwandtschaft der beiden Protein hin, die
Ähnlichkeit war jedoch zu gering, um eine HolPase-Funktion für das Protein aus N. maritimus ableiten zu können. Daher wurde eine in vitro Charakterisierung des Proteins aus N. maritimus durchgeführt, die die vermutete HolPase Aktivität bestätigte und zeigte, dass das Protein in wässriger Lösung als Monomer vorliegt und einen Schmelzpunkt von 37 °C besitzt. Im Einklang mit früher verwendeter Nomenklatur wird daher für das Protein aus N. maritimus die Bezeichnung nmHisN vorgeschlagen. Die beobachtete HolPase-Funktion von nmHisN in Kombination mit der entfernten Verwandtschaft zur
HolPase aus T. onnurineus legt nahe, dass diesen beiden Proteinen repräsentativ für eine neue Klasse von deutlich divergierten HolPasen stehen könnten, die in der Domäne der Archaeen sehr weit verbreitet sein könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurde auf der Grundlage eines Alanin-Scans des aktiven Zentrums von nmHisN ein Fingerabdruck von HolPase-definierenden Resten erstellt, der die Identifizierung anderer archaeeller HolPasen ermöglichen sollte. Dieser Fingerabdruck besteht aus einem DY-Motiv, einem Lysin und einem Glutamat, von denen angenommen wird, dass sie einen
eindeutigen Hinweis auf eine HolPase Funktion darstellen. Anschließend wurde ein SSN erstellt, in dem Homologe von nmHisN in einer Vielzahl archaeeller Phyla gefunden wurden. In den Homologen zweier Phyla, nämlich der Thaumarchaeota und des Kandidatenphylums der Bathyarchaeota war der
Fingerabdruck hoch konserviert, was stark darauf hindeutete, dass es sich bei diesen Proteinen um HolPasen handelt. Darüber hinaus wurden Homologe in Euryarchaeota und, interessanterweise, auch in bakteriellen δ-Proteobakterien identifiziert, die drei der vier Aminosäuren aus dem Fingerabdruck
enthielten. Das weist darauf hin, dass auch diese Proteine HolPase-Funktion besitzen. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse dieses Teils, dass die HolPasen von N. maritimus und T. onnurineus neben paHisN und ecHisB-N einen dritten HolPase-Typ aus der HAD-Superfamilie darstellen. Diese Art HolPase scheint in Archaeen weit verbreitet zu sein, was auf eine frühe
Entwicklung hinweist. Die vorgeschlagene Annotation dieser Proteine als HolPasen trägt außerdem dazu bei, diese bestehende Wissenslücke über die Histidin-Biosynthese von Archaeen zu schließen. Im vierten Teil der Arbeit wird der Frage nach funktionalen Übergängen und der allgemeinen Evolvierbarkeit der HAD-Superfamilie nachgegangen. Konkret wurde ein möglicher funktionaler Übergang von einer PSPase zu einer HolPase analysiert, wie er im Fall der Entstehung von paHisN naheliegt. Als Modellenzym diente die PSPase aus E. coli ecSerB, die in vitro keine messbare HolPase zeigte. Mehrere Aminosäuren des aktiven Zentrums wurden gleichzeitig randomisiert und anschließend auf ihre Fähigkeit getestet, einem ΔholPase Stamm Wachstum auf Minimalmedium zu ermöglichen.
Metadaten zuletzt geändert: 13 Okt 2023 09:09
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