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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-552864
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.55286
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 9 January 2024 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard Weber |
| Date of exam: | 18 December 2023 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | Retinal organoids, retinal pigment epithelium, organoid coculture, retinitis pigmentosa, RP1 |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 55286 |
Abstract (English)
The discovery of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived retinal organoids (ROs) provided a new avenue for retinal research to scientists worldwide. ROs are a unique model system composed of main neuroretinal cell types with a similar structure to the native tissue. However, they have notable drawbacks, including underdeveloped photoreceptor outer segments (OSs) and the lack of ...
Abstract (English)
The discovery of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived retinal organoids (ROs) provided a new avenue for retinal research to scientists worldwide. ROs are a unique model system composed of main neuroretinal cell types with a similar structure to the native tissue. However, they have notable drawbacks, including underdeveloped photoreceptor outer segments (OSs) and the lack of physiological contact between photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. Consequently, the applications of ROs as a model for disorders affecting photoreceptor-RPE system, such as retinitis pigmentosa (RP), are restricted.
The objective of this thesis was to discover effective methods to overcome this constraint. The RO differentiation protocol was modified to produce RPE cells (bRPE) as a byproduct. This involved extended culturing of the hiPSCs that had not matured into ROs, using nicotinamide to promote RPE development. The adapted protocol was tested in multiple differentiations of three hiPSC lines derived from healthy donors. The bRPE cells exhibited typical RPE morphology and characteristic protein expression in immunofluorescent stainings. In qRT-PCR analysis, three RPE markers were significantly upregulated compared to undifferentiated hiPSCs. Based on the results, it can be concluded that the modified differentiation protocol successfully and consistently produced RPE cells.
This thesis evaluated two approaches to coculture ROs with bRPE cells, intending to promote physical contact between photoreceptors and bRPE. Two coculture experiments were conducted in suspension while testing the first method. Many bRPE cells detached from the RO surface within a few days despite close contact being established between them. A second approach involved culturing under adherent conditions. In this experiment, the bRPE cells were grown as a monolayer on transwell filter inserts. ROs temporarily adhered to the bRPE but detached during harvest. Still, cocultured bRPE stained positive for rhodopsin, a photoreceptor OS marker, providing evidence of a functional connection between the two. Although our experiments did not show an improved OS structure in cocultures, they confirmed a physiological interaction between ROs and bRPE. This provides a solid foundation for future RO-RPE coculture experiments.
Finally, this study investigated hiPSC clones treated with CRISPR/Cas9 to induce novel mutations in the Retinitis Pigmentosa 1 Axonemal Microtubule Associated (RP1) gene. Mutations in the RP1 gene often lead to RP, a genetic condition linked to the degeneration of photoreceptors. One hiPSC clone was found to carry a novel homozygous mutation, which is believed to result in the RP1-knockout phenotype. Future differentiation of ROs from this hiPSC clone may provide a framework for studying the functions of the RP1 protein and RP pathogenesis.
Translation of the abstract (German)
Die Forschung an Erkrankungen der menschlichen Netzhaut steht stets vor der Herausforderung, ein wissenschaftliches Model zur Verfügung zu haben, das vielfältige Eigenschaften der menschlichen Netzhaut möglichst realistisch nachahmen kann. Als vor einigen Jahren Protokolle für Differenzierung von retinalen Organoiden (ROs) aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) publiziert ...
Translation of the abstract (German)
Die Forschung an Erkrankungen der menschlichen Netzhaut steht stets vor der Herausforderung, ein wissenschaftliches Model zur Verfügung zu haben, das vielfältige Eigenschaften der menschlichen Netzhaut möglichst realistisch nachahmen kann. Als vor einigen Jahren Protokolle für Differenzierung von retinalen Organoiden (ROs) aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) publiziert wurden, hat die wissenschaftliche Welt sie als Durchbruch in der Netzhautforschung angesehen. ROs enthalten alle Hauptzelltypen der menschlichen Netzhaut und erinnern in ihrer Struktur prinzipiell an dieses Gewebe in vivo. Sie weisen jedoch erhebliche Einschränkungen auf. Gerade für Forscher, die das Zusammenspiel von Photorezeptoren und retinalem Pigmentepithel (RPE) untersuchen wollen, stellen der fehlende physiologische Kontakt zwischen diesen Zelltypen und unterwickelte Außensegmente der Photorezeptoren einen großen Nachteil der ROs als Modellsystem dar.
Diese Dissertation erarbeitete ein modifiziertes Protokoll zur Differenzierung von ROs, mit einer gleichzeitigen Erzeugung von hochqualitativem RPE, genannt bRPE. Die hiPSCs, die sich nicht zu Organoiden differenzierten, dienten hierbei als Grundlage für die RPE- Differenzierung mittels Zellmedium-Zusatzstoff Nikotinamid. Das adaptierte Protokoll wurde mit drei hiPSC-Zelllinien, die von gesunden Spendern stammen, getestet. In jeder Differenzierung konnten pigmentierte Zellen gewonnen werden, die eine RPE-typische Morphologie aufwiesen und spezifische RPE-Zellproteine in den immunzytochemischen Untersuchungen exprimierten. Die signifikant höhere Expression von drei RPE-Markern im Vergleich zu hiPSC konnte mittels qRT-PCR (Englisch: quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unser modifiziertes Protokoll zu erfolgreicher und zuverlässiger Differenzierung von RPE führt.
In einem weiteren Teilprojekt wurden zwei Bedingungen für gemeinsame Kultivierung von ROs und bRPE-Zellen in drei Experimenten untersucht. Zweimal wurden ROs mit bRPE in Suspension kultiviert. Viele bRPE-Zellen lösten sich innerhalb weniger Tage von der RO-Oberfläche, obwohl zwischen ihnen physischer Kontakt bestand. Im dritten Experiment wurden ROs auf der Monoschicht aus den bRPE-Zellen kultiviert. Die ROs hafteten vorübergehend am bRPE, lösten sich aber während des Ernteprozesses. Dennoch färbten sich die bRPE-Zellen positiv für Rhodopsin, einen Marker für Außensegmente von Photorezeptoren. Diese Erkenntnis weist auf eine funktionelle Beziehung zwischen Organoiden und bRPE hin. Durch unsere Versuche, ROs mit bRPE zu kultivieren, wurde eine solide Grundlage für zukünftige Experimente geschaffen. Die Etablierung von einem robusten Modell für gemeinsame Kultivierung dieser Zellarten würde ROs näher an den physiologischen Zustand bringen und ihre Anwendungen in der Netzhautforschung wesentlich erweitern.
Zusätzlich untersuchte dieses Projekt hiPSC-Klone, die mit CRISPR/Cas9-Methode behandelt wurden, um gezielt DNA-Veränderungen im Retinitis Pigmentosa 1 Axonemal Microtubule Associated (RP1) Gen zu induzieren. Mutationen im RP1-Gen sind eine häufige Ursache für Retinitis pigmentosa, eine genetische Erkrankung, die mit der Degeneration von Photorezeptoren verbunden ist. Es wurde festgestellt, dass ein hiPSC-Klon eine neuartige homozygote Mutation im RP1-Gen trägt, die aller Voraussicht nach zum RP1-Knockout- Phänotyp führt. Die zukünftige Differenzierung von ROs aus diesem hiPSC-Klon könnte einen Ausgangspunkt für die Untersuchung der Funktionen des RP1-Proteins und der Pathogenese der Retinitis pigmentosa in diesem faszinierenden Netzhautmodel bieten.
Metadata last modified: 09 Jan 2024 07:48
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