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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-553144
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.55314
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 8 Januar 2026 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Remco Sprangers |
| Tag der Prüfung: | 19 Dezember 2023 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Remco Sprangers |
| Stichwörter / Keywords: | Nuclear Magnetic Resonance, mRNA Decay, Dcp1:Dcp2 mRNA Decapping Complex |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 55314 |
Zusammenfassung (Englisch)
Controlled degradation of messenger RNA (mRNA) is essential for the regulation of gene expression. The removal of the protective 5’ cap structure of eukaryotic mRNA is a central step in this process and it is catalyzed by the Dcp1:Dcp2 decapping complex. During catalysis, Dcp1:Dcp2 undergoes large conformational changes which are regulated by interactions with several activator proteins including ...
Zusammenfassung (Englisch)
Controlled degradation of messenger RNA (mRNA) is essential for the regulation of gene expression. The removal of the protective 5’ cap structure of eukaryotic mRNA is a central step in this process and it is catalyzed by the Dcp1:Dcp2 decapping complex. During catalysis, Dcp1:Dcp2 undergoes large conformational changes which are regulated by interactions with several activator proteins including Edc1 and Edc3. The exact details of these structural rearrangements and their functional role in the decapping process are not fully understood yet. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a well suited method to study dynamic processes and conformational changes of enzymes. In my dissertation I therefore made use of different NMR experiments and complementary techniques to study the mRNA decapping machinery from S. pombe in detail.
In Part III, I used 13CH3 methyl group labeling of Dcp2 and conducted methyl Carr–Purcell–Meiboom–Gill (CPMG) NMR relaxation dispersion (RD) experiments on the Dcp1:Dcp2 decapping complex at high hydrostatic pressures. From these experiments I extracted information about the molecular volumes of the different conformations of the complex during the opening-closing pathway and about the effect of ATP on these volumes. This information could not be reliably obtained from known crystal structures, which underlines the potential of pressure-dependent NMR methods to provide insights into structural features of invisible protein conformations, even for high molecular weight complexes.
In Part IV, I examined the applicability of 5-fluorotryptophan labeling for studying protein dynamics with 19F NMR experiments in three different biomolecular systems, namely the Dcp1:Dcp2 mRNA decapping complex, the KIX domain of the transcriptional coactivator CREB binding protein and the DcpS scavenger decapping enzyme. I found that the 19F label on the 5-tryptophan has no measureable effect on the backbone dynamics of the examined proteins and slow protein motions could reliably be extracted from 19F NMR experiments that are insensitive to tryptophan side chain motions. In contrast, I found that NMR relaxation experiments on the 19F nucleus in this position do not always allow for the reliable extraction of kinetic and thermodynamic properties, so these data should always be supported by data from complementary techniques.
In Part V, I performed single molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) experiments on the decapping complex. We first optimized the labeling positions of the fluorophores by testing several different combinations of labeling sites and cross-validated them with NMR experiments of fluorophore labeled Dcp1:Dcp2 complexes. In subsequent smFRET measurements I confirmed previously obtained NMR data and I examined the influence of different cofactors and substrates that are not suited for NMR experiments. Importantly, as the fluorophore labeling can influence the conformational equilibrium of the decapping complex, cross-validation of smFRET data is crucial for a correct interpretation of the FRET efficiencies.
In the presence of Edc3, the Dcp1:Dcp2 mRNA decapping complex undergoes liquid-liquid phase separation (LLPS) and maturation into a gel-like state, about which little is still known. To examine changes in conformation and dynamics of Edc3 and Dcp2 in the transition to the mature state, we performed solid state NMR (ssNMR) experiments on mature Edc3 and Dcp1:Dcp2 (Part VI). We construct a model in which, after LLPS, the factors of the mRNA decapping machinery mature into a structurally inhomogeneous, gel-like state in which the molecular motions and intermolecular contacts that are averaged in solution are frozen out and no longer averaged. Our findings demonstrate the great capacity of ssNMR to study large molecular machines in the condensed, phase separated state.
Taken together, these results contribute to our knowledge of how conformational changes regulate mRNA decapping and, ultimately, add to a better understanding of how large molecular machines function.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der kontrollierte Abbau von Boten-RNA (mRNA) ist essentiell für die Regulation der Genexpression. Ein zentraler Schritt in diesem Prozess ist die Entfernung der schützenden 5’-Cap-Struktur der eukaryotischen mRNA und dieser wird durch den Dcp1:Dcp2-Decapping-Komplex katalysiert. Während der Katalyse durchläuft Dcp1:Dcp2 große Konformationsänderungen, die durch Wechselwirkungen mit verschiedenen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der kontrollierte Abbau von Boten-RNA (mRNA) ist essentiell für die Regulation der Genexpression. Ein zentraler Schritt in diesem Prozess ist die Entfernung der schützenden 5’-Cap-Struktur der eukaryotischen mRNA und dieser wird durch den Dcp1:Dcp2-Decapping-Komplex katalysiert. Während der Katalyse durchläuft Dcp1:Dcp2 große Konformationsänderungen, die durch Wechselwirkungen mit verschiedenen Aktivatorproteinen, darunter Edc1 und Edc3, reguliert werden. Die genauen Details dieser strukturellen Änderungen und ihre funktionelle Rolle im Decapping-Prozess sind noch nicht vollständig verstanden. Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist eine gut geeignete Methode, um dynamische Prozesse und Konformationsänderungen von Enzymen zu untersuchen. In meiner Dissertation habe ich daher verschiedene NMR-Experimente und ergänzende Techniken verwendet, um die mRNA-Abbaumaschinerie von S. pombe im Detail zu untersuchen.
In Part III verwendete ich die 13CH3 -Methylgruppenmarkierung von Dcp2 und führte Methyl-Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) NMR Relaxationsdispersionsexperimente (RD-Experimente) am Dcp1:Dcp2-Komplex bei hohem hydrostatischen Druck durch. Aus diesen Experimenten erhielt ich Informationen über die molekularen Volumina der verschiedenen Konformationen des Komplexes während seines Öffnungs- und Schließvorgangs und über die Wirkung von ATP auf diese Volumina. Diese Informationen konnten nicht zuverlässig aus bekannten Kristallstrukturen gewonnen werden, was das Potenzial druckabhängiger NMR-Methoden unterstreicht, Einblicke in strukturelle Eigenschaften unsichtbarer Proteinkonformationen, selbst von Komplexen mit hohem Molekulargewicht, zu erhalten.
In Part IV untersuchte ich die Anwendbarkeit der 5-Fluortryptophan-Markierung zur Messung von Proteindynamik mit 19F-NMR-Experimenten und verwendete dazu drei verschiedene Systeme, nämlich den Dcp1:Dcp2-Komplex, die KIX-Domäne des transkriptionellen Koaktivators CREB-Bindungsprotein und das Scavenger-Decapping-Enzym DcpS. Ich fand heraus, dass die Markierung mit 19F auf dem 5-Tryptophan keinen messbaren Einfluss auf die Dynamik des Rückgrats der untersuchten Proteine hat und dass langsame Proteinbewegungen zuverlässig aus 19F-NMR-Experimenten extrahiert werden konnten, die unempfindlich gegenüber Tryptophan-Seitenkettenbewegungen sind. Im Gegensatz dazu habe ich festgestellt, dass NMR-Relaxationsexperimente am 19F-Kern an dieser Position nicht immer eine zuverlässige Extraktion kinetischer und thermodynamischer Eigenschaften zulassen, sodass diese Daten immer durch Daten aus komplementären Techniken gestützt werden sollten.
In Part V führte ich Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer-Experimente (smFRET-Experimente) am Dcp1:Dcp2-Komplex durch. Wir optimierten zunächst die Markierungspositionen der Fluorophore, indem wir verschiedene Kombinationen von Markierungspositionen testeten und diese mit NMR-Experimenten an Fluorophor-markierten Dcp1:Dcp2-Komplexen überprüften. In anschließenden smFRET-Messungen bestätigte ich die zuvor erhaltenen NMR-Daten und untersuchte den Einfluss verschiedener Kofaktoren und Substrate, die für NMR-Experimente nicht geeignet sind. Da die Fluorophor-Markierung das Konformationsgleichgewicht des Dcp1:Dcp2-Komplexes beeinflussen kann, ist eine Kreuzvalidierung der smFRET-Daten für die korrekte Interpretation der FRET-Effizienzen von entscheidender Bedeutung.
In Gegenwart von Edc3 durchläuft der Dcp1:Dcp2-Komplex eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) und nimmt einen gelartigen Zustand an, über den bisher wenig bekannt ist. Um die Konformationsänderungen und die Dynamik von Edc3 und Dcp2 nach dem Übergang in den gelartigen Zustand zu untersuchen, führten wir Festkörper-NMR-Experimente (ssNMR-Experimente) an Edc3 und Dcp1:Dcp2 im Gelzustand durch (Part VI). Wir entwerfen ein Modell, in dem die Faktoren der mRNA-Decapping-Maschinerie nach LLPS in einen strukturell inhomogenen, gelartigen Zustand übergehen, in dem die in Lösung gemittelten Molekularbewegungen und intermolekularen Kontakte eingefroren sind und nicht mehr gemittelt werden.
Unsere Ergebnisse zeigen die gute Eignung der ssNMR zur Untersuchung großer molekularer Maschinen im kondensierten, phasengetrennten Zustand. Zusammengefasst tragen diese Ergebnisse zu unserem Verständnis bei, wie Konformationsänderungen den Abbau der mRNA-Cap-Struktur regulieren, wodurch letztlich ein tieferes Verständnis der Funktionsweise großer molekularer Maschinen gewonnen wird.
Metadaten zuletzt geändert: 08 Jan 2026 05:35
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