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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-580144
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.58014
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 1 Oktober 2024 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Jörg Heilmann |
| Tag der Prüfung: | 22 März 2024 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie (Prof. Heilmann) |
| Stichwörter / Keywords: | Myrrhe, Commiphora myrrha, Sesquiterpene, Cyclo-Verbindungen, Sesquiterpen-Dimer, ICAM-1, Grieß-Assay, Synergie |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 615 Pharmazie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 58014 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Myrrhe wird seit dem Altertum zur Behandlung verschiedenster, oftmals entzündlicher Erkrankungen verwendet. Moderne Untersuchungen konnten insbesondere die antiinflammatorische, antibakterielle und analgetische Wirksamkeit des Gummiharzes von Commiphora myrrha belegen. Für Colitis ulcerosa (CU) ist sie aufgrund positiver Effekte in Tiermodellen sowie in einer klinischen Studie in Kombination mit ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Myrrhe wird seit dem Altertum zur Behandlung verschiedenster, oftmals entzündlicher Erkrankungen verwendet. Moderne Untersuchungen konnten insbesondere die antiinflammatorische, antibakterielle und analgetische Wirksamkeit des Gummiharzes von Commiphora myrrha belegen. Für Colitis ulcerosa (CU) ist sie aufgrund positiver Effekte in Tiermodellen sowie in einer klinischen Studie in Kombination mit Kaffeekohle und Kamillenblütenextrakt etabliert. Trotz der vielversprechenden Ergebnisse sind zum einen die hydrophileren Inhaltsstoffe des Harzes, zum anderen deren molekularer Wirkmechanismus immer noch unzureichend geklärt. Im Rahmen dieser Arbeit soll daher ein Beitrag zur Charakterisierung der sekundären Metaboliten in Myrrhe und zum Verständnis deren Pharmakologie sowie deren Interaktion mit den weiteren Drogen im Kombinationsarzneimittel geleistet werden. Als in vitro Tests wurden Modelle anhand des von HMEC-1-Zellen exprimierten interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 sowie des durch RAW 264.7-Makrophagen produzierten Immunregulators Stickstoffmonoxid (NO) gewählt, die beide bei CU-Patienten pathologisch erhöht sind.
Untersucht wurde die hydrophilere Methanol-Fraktion eines zwischen Methanol und n-Heptan zweigeteilten, ethanolischen Myrrheextraktes anhand einer teils bioaktivitätsgeleiteten Isolierung. Die nach Festphasenextraktion und Flash-Chromatographie über Kieselgel erhaltenen Fraktionen wurden im ICAM-1-Assay getestet, wobei Fraktion F1.4 am aktivsten war (Senkung auf 63%, 25 µg/ml). Diese wurde daher neben den beiden sehr kleinen Fraktionen F1.1 und F1.2 nachfolgend weiter aufgetrennt durch Kombination verschiedener chromatographischer Methoden wie mehrerer Flash-Chromatographien, Zentrifugalverteilungschromatographie und semi-präparativer HPLC an RP-18- bzw. Biphenyl-Phasen.
Anhand von HRESIMS und NMR-Spektroskopie wurden 59 Substanzen identifiziert, die teils auch als Mischungen vorlagen, und optisch, spektroskopisch sowie über die HPLC-DAD-Reinheitsuntersuchung charakterisiert. Die Kohlenstoffskelette der Isolate lassen sich in zehn verschiedene Sesquiterpen-Typen einteilen (Germacrane, Cyclo-, Nor-, Seco- und Eudesmane, Eremophilane, Elemane, Guaiane, Secoguaiane und Cadinane), daneben wurden ein heterodimeres Sesquiterpen, vier Triterpenoide und ein Lignan gefunden. Vor allem aus der hydrophileren F1.4 wurden viele bisher nicht beschriebene Verbindungen erhalten. 23 Verbindungen sind in ihrer relativen Konfiguration erstmalig beschrieben (10–13, 15, 17, 20, 22, 25, 31, 34–42, 45, 53, 54, 59), sowie eine erstmals als Naturstoff (27). Mit Substanz 38 wurde ein erster Vertreter des überbrückten 4,8-Cycloeudesman-Typs identifiziert. 15 Substanzen wurden daneben erstmals in der Gattung Commiphora nachgewiesen (14, 16, 18, 19, 21, 23, 26, 28, 30, 32, 33, 43, 44, 48, 51). Die ersten Vertreter vom Noreudesman- (39) und Eremophilan-Typ (43, 44) für die Gattung wurden gefunden und Substanz 59 stellt das erste für C. myrrha beschriebene Lignan vom Aryltetralin-Typ dar. Für Substanzen 1, 50 und 51 konnten zudem Literaturdaten korrigiert werden. Darüber hinaus wurden drei sesquiterpenoide Artefakte analysiert, welche teils durch säurekatalysierte Umlagerung in CDCl3, teils trotz schonender Handhabung entstanden.
Ausgewählte Isolate wurden ferner auf ihre Effekte auf die ICAM-1-Expression sowie die NO-Freisetzung untersucht. Während im ersten Modell nur Commiterpen E (53) einen schwachen signifikanten Effekt zeigte, waren im zweiten neun Verbindungen signifikant, schwach bis moderat aktiv. Einzig für die Referenzsubstanz Furanoeudesma-1,3-dien konnte eine halbmaximale Hemmkonzentration mit 46,0 µM bestimmt werden, welche nicht allein durch NO-Radikalfang erklärbar scheint. Da die Testsubstanzen keine α-Methylen-γ-Lacton-Funktionalität besitzen, deuten diese Ergebnisse auf mindestens ein weiteres wirksamkeitsmitbestimmendes Strukturelement und daher vermutlich eine Mehrzahl an Targets hin. Die Verbindungen stellen somit wohl einen kleinen Teil der molekularen Erklärung der entzündungshemmenden Wirkung von Myrrhe dar.
Ferner wurde Kaffeekohle wässrig extrahiert und als Inhaltsstoffe anhand Referenzsubstanzen Coffein, Chlorogensäurederivate und Trigonellin identifiziert. Die Untersuchung dieses Kaffeekohleextraktes (IC50 924 µg/ml), des ethanolischen Myrrhe- sowie des ethanolischen Kamillenblütenextraktes auf die ICAM-1-Expression zeigte für Myrrhe die stärkste Aktivität (IC50 150 µg/ml). Die Testung einer Mischung der Extrakte zu gleichen Anteilen ergab einen Kombinationsindex von 0,83, der als moderater Synergismus einzuordnen ist. Diese Interaktion erweitert die Evidenz der traditionellen Kombination auf einen weiteren bei CU relevanten Faktor.
Trotz dieser erreichten Beiträge sind weitere Untersuchungen nötig, um 1. die strukturvielfältige Zusammensetzung von Myrrhe aufzuklären, 2. die Struktur-Wirkungs-Beziehungen der Inhaltsstoffe herauszufinden, sowie 3. die molekularen Angriffspunkte und so möglicherweise eine Erklärung für synergistische Effekte zu finden. Dies würde nicht nur die Evidenz des therapeutischen Einsatzes von Myrrhe erweitern, sondern könnte ebenso weitere pharmazeutische Nutzungsmöglichkeiten eröffnen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Myrrh has been used since ancient times to treat a wide variety of, often inflammatory, diseases. Modern studies demonstrated particularly the anti-inflammatory, antibacterial and analgesic effectiveness of the gum resin from Commiphora myrrha. It is established in the treatment of ulcerative colitis (UC) due to positive effects in animal models and in a clinical study in combination with coffee ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Myrrh has been used since ancient times to treat a wide variety of, often inflammatory, diseases. Modern studies demonstrated particularly the anti-inflammatory, antibacterial and analgesic effectiveness of the gum resin from Commiphora myrrha. It is established in the treatment of ulcerative colitis (UC) due to positive effects in animal models and in a clinical study in combination with coffee charcoal and chamomile flower extract. Despite the promising results, the more hydrophilic ingredients of the resin and their molecular mechanism of action are still insufficiently understood. The aim of this work is to contribute to the characterization of the secondary metabolites in myrrh and to the understanding of their pharmacology as well as their interaction with the other drugs in the combined preparation. The models chosen as in vitro tests are based on the intercellular adhesion molecule ICAM-1 expressed by HMEC-1 cells and the immune regulator nitric oxide (NO) produced by RAW 264.7 macrophages, both of which are pathologically elevated in UC patients.
The methanol fraction of an ethanolic myrrh extract, that has been divided into two parts between methanol and n-heptane, was examined using a partially bioactivity-guided isolation. The fractions obtained after solid phase extraction and flash chromatography on silica gel were evaluated in the ICAM-1 assay, with fraction F1.4 being the most active (decrease to 63%, 25 µg/ml). In addition to the two small fractions F1.1 and F1.2, this fraction was subsequently further separated by a combination of various other chromatographic methods such as several flash chromatographies, centrifugal partition chromatography and semi-preparative HPLC on RP-18 or biphenyl phases.
Using HRESIMS and NMR spectroscopy, 59 substances were identified, some of which were also present as mixtures, and were characterized optically, spectroscopically and using HPLC-DAD purity testing. The carbon skeletons of the isolates belong to ten different sesquiterpene types (germacranes, cyclo-, nor-, seco- and eudesmanes, eremophilans, elemanes, guaianes, secoguaianes and cadinanes), furthermore one heterodimeric sesquiterpene, four triterpenoids and one lignan were found. Previously undescribed compounds were obtained especially from the more hydrophilic F1.4. 23 compounds were found for the first time in their relative configuration (10–13, 15, 17, 20, 22, 25, 31, 34–42, 45, 53, 54, 59), and one was described for the first time as a natural product (27). With substance 38, a first representative of the bridged 4,8-cycloeudesman type was identified. In addition, 15 substances were detected for the first time in the genus Commiphora (14, 16, 18, 19, 21, 23, 26, 28, 30, 32, 33, 43, 44, 48, 51). The first representatives of the noreudesmane (39) and eremophilane types (43, 44) were found for the genus and substance 59 represents the first lignan of the aryltetralin type described for C. myrrha. Literature data were corrected for substances 1, 50 and 51. In addition, three sesquiterpenoid artifacts were analyzed, some of which were caused by acid-catalyzed rearrangement in CDCl3, and some of which arose despite careful handling.
Selected isolates were further examined for their effects on ICAM-1 expression and NO release. While in the former model only commiterpene E (53) showed a weak significant effect, in the latter nine compounds were significantly, weakly to moderately active. Only for the reference substance Furanoeudesma-1,3-diene, a half-maximal inhibitory concentration of 46.0 µM could be determined, which does not seem to be explainable by NO radical scavenging alone. Since the test substances do not have any α-methylene-γ-lactone functionality, the results indicate at least one additional structural element that determines effectiveness, and thus possibly a plurality of targets. The compounds therefore probably represent a small part of the molecular explanation of the anti-inflammatory effect of myrrh.
Furthermore, coffee charcoal was extracted with water, and caffeine, chlorogenic acid derivatives and trigonelline were identified as ingredients using reference substances. The examination of this coffee charcoal extract (IC50 924 µg/ml), the ethanolic myrrh extract and the ethanolic chamomile flower extract for ICAM-1 expression showed the strongest activity for myrrh (IC50 150 µg/ml). Analysis of a mixture of the extracts in equal proportions resulted in a combination index of 0.83, which indicates moderate synergism. This interaction extends the evidence of the traditional combination to an additional factor relevant to UC.
Despite these contributions, further investigations are necessary in order to 1. clarify the structurally diverse composition of the myrrh, 2. reveal the further structure-activity relationships, and 3. find the molecular targets and thus possibly an explanation for synergistic effects. This would not only expand the evidence for the therapeutic use of myrrh but could also facilitate further pharmaceutical uses.
Metadaten zuletzt geändert: 01 Okt 2024 07:04
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