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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-581971
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.58197
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | Mai 2024 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Matthias Mack |
| Tag der Prüfung: | 9 April 2024 |
| Institutionen: | Medizin > Abteilung für Nephrologie |
| Stichwörter / Keywords: | Monozyten und COVID-19; T-Zell-Hyporeaktivität und COVID-19; Monozytensubpopulationen und COVID-19 |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 58197 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Seit Anfang des Jahres 2020 beeinflusst SARS-CoV-2 und die durch dieses Virus ausgelöste Erkrankung COVID-19 das Weltgeschehen durch zahlreiche Erkrankungs- und Todesfälle. Ziel dieser Dissertation war es, die Aktivierung von Monozytensubpopulationen bei Patienten mit dieser Erkrankung zu untersuchen. Dabei sollte ein Zusammenhang zwischen Krankheitsschwere und Aktivierungsgrad der jeweiligen ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Seit Anfang des Jahres 2020 beeinflusst SARS-CoV-2 und die durch dieses Virus ausgelöste Erkrankung COVID-19 das Weltgeschehen durch zahlreiche Erkrankungs- und Todesfälle.
Ziel dieser Dissertation war es, die Aktivierung von Monozytensubpopulationen bei Patienten mit dieser Erkrankung zu untersuchen. Dabei sollte ein Zusammenhang zwischen Krankheitsschwere und Aktivierungsgrad der jeweiligen Monozytensubpopulation herausgearbeitet werden. Zusätzlich erfolgte die Analyse weiterer Zelltypen, wie den plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDCs), den basophilen und neutrophilen Granulozyten sowie den CD4+- und CD8+-T-Zellen, um die Rolle der Monozyten in der Immunantwort auf das Krankheitsgeschehen besser nachvollziehen zu können.
Dafür wurden Lithium-Heparin-Vollblutproben von insgesamt 55 COVID-19-Patienten und 42 gesunden Kontrollpersonen mit drei verschiedenen Antikörper-Mastermixen angefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Die auf diese Weise untersuchten Zelltypen waren plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs), basophile Granulozyten, CD4+-T-Zellen, CD8+-T-Zellen, neutrophile Granulozyten (CD11b), CD14+-Monozyten (CD169) und CD16+-Monozyten (CD169) sowie die bei den letzten drei Zelltypen in Klammern angegebenen Oberflächenmarker. Diese Marker dienten als Kennzeichen für den Aktivierungsgrad des jeweiligen Zelltyps.
Zusätzlich wurden die Vollblutproben mit Stimulanzien versetzt. Nach 24 Stunden Inkubationszeit wurde ihre Zytokinausschüttung sowie die Regulation spezifischer Oberflächenrezeptoren der einzelnen Zelltypen gemessen. Dies wurde im Rahmen der Promotion “Untersuchung der Expression von IL-3 und seinem Rezeptor bei COVID-19-Patienten” meiner Laborpartnerin Christine Müller durchgeführt und wird daher in ihrer Promotion dargestellt.
Ein Vorversuch legte die Basis für diese Vollblutstimulationen und die Stimulationen der aus einigen Patientenproben aufbereiteten PBMCs (peripheral blood mononuclear cells), indem er die Regulationsfähigkeit der Oberflächenrezeptoren der verschiedenen Zelltypen auf unterschiedliche Zytokinstimulationen untersuchte.
Die PBMCs wurden zunächst aufgetaut, aufbereitet und auf eine vergleichbare Zellkonzentration eingestellt. Damit die Ausschüttung verschiedener Zytokine durch die PBMCs analysiert werden konnte, wurden die Proben jeweils mit verschiedenen Stimulanzien (unter anderem Anti-CD3 und Anti-CD3 + IL-2) sowie Medium versetzt und 23,5 Stunden inkubiert. Danach wurde der Überstand abgenommen und mittels ELISA auf die Zytokine IL-3, GM-CSF und IFN-γ untersucht. Die verbliebenen Zellen wurden mit fluoreszierenden Antikörpern angefärbt und durchflusszytometrisch analysiert.
Die Erkrankten wurden in verschiedene Schweregrade eingeteilt: nicht-beatmet, beatmet - überlebend und beatmet - verstorben.
Bei der Analyse der Patientendaten zeigte sich, dass die beatmeten Patienten erhöhte Entzündungszeichen aufwiesen. Zugleich ließen sich in der Immunphänotypisierung bei schweren Verläufen deutlich weniger pDCs, basophile Granulozyten und CD16+-Monozyten in den Blutproben nachweisen, während bei den CD14+-Monozyten kein Unterschied zu finden und die Anzahl der neutrophilen Granulozyten erhöht war. Die niedrigere Anzahl der erwähnten Zelltypen ließe sich durch eine verstärkte Migration dieser in das erkrankte Gewebe erklären.
Bei der Analyse der Oberflächenmarker CD11b auf neutrophilen Granulozyten und CD169 auf Monozyten, die für ihren jeweiligen Zelltyp als Aktivierungsmarker fungierten, zeigte sich, dass die Expression von CD11b bei Erkrankten insgesamt erhöht war, aber innerhalb dieser Gruppe mit zunehmender Krankheitsschwere stetig abnahm. Die grundsätzlich stärkere Expression von CD11b spricht für eine stärkere Aktivierung der neutrophilen Granulozyten, die aber mit zunehmender Schwere der Erkrankung abnimmt. Dies könnte möglicherweise mit einer schwächeren Stimulation durch hyporeaktive T-Zellen zu erklären sein. Der Oberflächenmarker CD169 wurde bei beiden Monozytensubpopulationen bei den Erkrankten ausgeprägter exprimiert, was für eine Aktivierung dieser Zellen spricht. Die Expression nahm aber bei den CD14+-Monozyten zu den Beatmeten hin signifikant ab. Diese Abnahme ließe sich durch eine geringere Produktion von Typ-I-Interferonen in dieser Patientengruppe erklären.
Im Rahmen der Promotion “Untersuchung der Expression von IL-3 und seinem Rezeptor bei COVID-19-Patienten” meiner Laborpartnerin Christine Müller wurde eine T-Zell-Hyporeaktivität bei schweren Verläufen festgestellt, die sich in einer schwachen Hochregulation der Oberflächenrezeptoren CD11b auf neutrophilen Granulozyten und CD123 auf Monozyten nach Stimulation der Blutproben sowie einer niedrigen Anzahl an basophilen Granulozyten äußerte. Dass diese Hyporeaktivität nicht allein durch eine erniedrigte Anzahl an T-Zellen ausgelöst wurde, zeigte sich in der Immunphänotypisierung: die Anzahl der T-Zellen unterschied sich bei den CD4+-T-Zellen im Vergleich zwischen gesunden Kontrollpersonen, Nicht-Beatmeten und Beatmeten nicht und bei den CD8+-T-Zellen wiesen nur die Nicht-Beatmeten signifikant höhere Werte auf, während die Anzahl bei Gesunden und Beatmeten vergleichbar war. Bei beiden T-Zell-Populationen zeigten nur die verstorbenen Beatmeten signifikant erniedrigte Zellzahlen.
Bei der Analyse der T-Zell-Hyporeaktivität und der Viruspersistenz zeigte sich, dass bei Patienten mit längerer Viruspersistenz eine längere T-Zell-Hyporeaktivität nachgewiesen werden konnte. Eine Erklärung für diese Korrelation wäre eine Induktion der Hyporeaktivität durch SARS-CoV-2, was eine längere Virusreplikation ermöglichen würde. Im Rahmen dieser würde durch die nicht von der Hyporeaktivität betroffenen Immunzellen, wie den auch durch das angeborene Immunsystem stimulierbaren, bei Erkrankten ausgeprägter aktivierten Monozyten, eine verstärkte Entzündungsreaktion mit nachfolgender Gewebeschädigung initiiert werden.
Die erlangten Ergebnisse ermöglichten die Entwicklung eines prädiktiven Scores, der anhand der schwachen Hochregulation von CD11b auf neutrophilen Granulozyten, der schwachen Hochregulation von CD123 auf Monozyten und einer geringen Anzahl an basophilen Granulozyten eine Vorhersage für schwere Verläufe ermöglichen könnte.
Die Analyse der Daten der PBMCs unterstützte die These der Hyporeaktivität der T-Zellen, da die T-Zellen der Verstorbenen der beatmeten Gruppe nach Stimulation eine deutlich geringer ausgeprägte Hochregulation des Aktivierungsmarkers CD25 zeigten. Zudem ließen sich bei der Analyse der Zytokin-ELISAs Hinweise finden, dass die zusätzliche Stimulation mit IL-2 zumindest eine teilweise Aufhebung der T-Zell-Hyporeaktivität ermöglicht. Aufgrund des Verlusts einiger Leukozytensubpopulationen bei der Aufbereitung der PBMCs sowie einer schwächeren Reaktivität einiger Zellgruppen, ist die Verwendung von PBMCs der Verwendung von Vollblutproben unterlegen, sodass die Ergebnisse unter Vorbehalt betrachtet werden müssen und weitere Studien zu den erlangten Erkenntnissen erforderlich scheinen.
So lässt sich zusammenfassen, dass die Monozyten und ihre Subpopulationen bei COVID-19 eine wichtige Rolle im Krankheitsgeschehen spielen. Sie lassen sich einerseits als Marker für die T-Zell-Hyporeaktivität einsetzen und andererseits als mögliche Ursache für die ausgeprägten Entzündungsreaktionen und Gewebeschädigungen bei schwereren Krankheitsverläufen heranziehen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Since the beginning of 2020 COVID-19 has had a great impact on people worldwide as this disease caused by the virus SARS-CoV-2 may result in serious outcomes and death. The aim of this dissertation was to examine the activation levels of different monocyte subtypes and connect these to the disease severity. Furthermore, other cell types like basophils, neutrophils, plasmacytoid dendritic ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Since the beginning of 2020 COVID-19 has had a great impact on people worldwide as this disease caused by the virus SARS-CoV-2 may result in serious outcomes and death.
The aim of this dissertation was to examine the activation levels of different monocyte subtypes and connect these to the disease severity. Furthermore, other cell types like basophils, neutrophils, plasmacytoid dendritic cells (pDCs) and CD4+- and CD8+-T-cells have been analyzed to comprehend the role of the monocytes during the immune response.
Fresh whole blood samples from 55 COVID-19 patients and 42 healthy controls were used for immunophenotyping by flow cytometry. Three different antibody mixes were chosen to identify different surface markers on the various cell types that were already mentioned. These surface markers show the activation level of a specific cell type.
Furthermore, the whole blood samples have been stimulated with different substances to measure the release of cytokines and the regulation of surface markers. These experiments have been performed by my laboratory partner Christine Müller and are therefore presented in her dissertation “Untersuchung der Expression von IL-3 und seinem Rezeptor bei COVID-19-Patienten”.
An experiment performed in advance examined the reactivity of surface markers on different types of substances, establishing the method used during the whole blood stimulation and the stimulation of the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
The PBMCs were thawed, prepared, and stimulated with Anti-CD3, Anti-CD3 + IL-2, IL-3 and medium and incubated. The supernatants were checked for the cytokines IL-3, GM-CSF, and IFN-γ using ELISA and the remnant cells were used for immunophenotyping by flow cytometry.
In general, patients were divided into different groups based on their disease severity: non-ventilated, ventilated – survived and ventilated – dead.
Ventilated patients had higher inflammation markers. Furthermore, the number of pDCs, basophils and CD16+-monocytes was decreased among people with serious disease severity whereas the number of CD14+-monocytes stayed the same and the number of neutrophils was higher. The decrease might be explained by an intensified migration into inflamed tissue.
Analyzation of the activation markers CD11b on neutrophils and CD169 on monocytes showed a general elevation of the expression of CD11b in patients in comparison with healthy controls, but a decrease of the expression of CD11b with increasing disease severity. The general elevation might be explained by activated neutrophils. A weaker activation might be caused by hyporeactive T-cells resulting in lower levels of CD11b. CD169 was expressed stronger on both monocyte subpopulations in patients signaling an activation of those cells. The expression on CD14+-monocytes decreased significantly in ventilated patients compared to other patient groups, suggesting a lower production of Type-I-interferons.
In her dissertation Christine Müller described a T-cell-hyporeactivity in patients with serious disease progression which was characterized by a weak upregulation of CD11b on neutrophils and CD123 on monocytes as well as a low count of basophils. This hyporeactivity was not only caused by a smaller number of T-cells: The number of CD4+-T-cells was the same in healthy controls, ventilated and non-ventilated patients. The number of CD8+-T-cells was significantly elevated in non-ventilated patients; healthy controls and ventilated patients had comparable numbers. Only deceased ventilated patients had significantly lower numbers of both T-cell-populations.
Analyzing virus persistency and T-cell-hyporeactivity showed a longer hyporeactivity in patients with longer virus persistency. A possible explanation might be an induction of the T-cell-hyporeactivity by SARS-CoV-2, making longer replication of the virus possible. Furthermore, cells that are not influenced by the T-cell-hyporeactivity might cause strong inflammation reactions with tissue damage. One possible kind of cell is the among patients strongly activated monocytes that can be activated by the innate immune system.
All these results led to the development of a predictive score that aims to predict serious disease progressions by combining a weak upregulation of CD11b on neutrophils and CD123 on monocytes as well as a low count of basophils.
The thesis of the T-cell-hyporeactivity is supported by the results from analysis of the PBMCs as the T-cell activation marker CD25 showed a weaker upregulation in deceased ventilated patients. Other results from analyzation of the PBMCs proposed a partial lifting of the T-cell-hyporeactivity after additional stimulation with IL-2. As some subgroups of leukocytes were missing in the PBMCs and other cell types were less responsive in PBMCs than in whole blood samples, the results must be handled with care and must be confirmed by studies with whole blood samples which seem to be superior.
To summarize, monocytes and monocyte subpopulations can be used as markers for T-cell-hyporeactivity and might also function as a possible cause for distinctive inflammation reactions and tissue damage among people with serious disease severity.
Metadaten zuletzt geändert: 07 Mai 2024 14:12
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