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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-584718
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.58471
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 31 März 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Christoph Engel und Prof. Dr. Dina Grohmann und Prof. Dr. Herbert Tschochner |
| Tag der Prüfung: | 25 April 2024 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie |
| Stichwörter / Keywords: | RNA polymerase I; human transcription; ribosomal RNA precursor; structural biochemistry |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 58471 |
Zusammenfassung (Englisch)
Transcription of DNA is a fundamental mechanism of every living cell and is carried out by at least three nuclear DNA-dependent RNA polymerases (Pols) in eukaryotes. Among these, Pol I is dedicated to the transcription of one specific gene. The resulting 47S ribosomal RNA (rRNA) precursor is further processed to 18S, 5.8S and 28S rRNA and incorporated into the cellular machinery for protein ...
Zusammenfassung (Englisch)
Transcription of DNA is a fundamental mechanism of every living cell and is carried out by at least three nuclear DNA-dependent RNA polymerases (Pols) in eukaryotes. Among these, Pol I is dedicated to the transcription of one specific gene. The resulting 47S ribosomal RNA (rRNA) precursor is further processed to 18S, 5.8S and 28S rRNA and incorporated into the cellular machinery for protein translation, the ribosome. Pol I is a major determinant of cellular growth. Mutations or deregulation of the Pol I transcription system have been found to be linked to severe (neuro-)developmental diseases and many types of cancer, pointing to the direct link between human health and proper Pol I transcription. The last years, the spotlight of modern medicine turned on the Pol I system, investigating different drugs targeting Pol I transcription as cancer-treatment strategy. Nevertheless, basic Pol I research has been mainly performed in the yeast system and a detailed understanding on a mechanistic, structural, and functional level was still missing for the human enzyme. My overall research aim was to investigate which mechanisms known from the yeast Pol I system can be transferred to human and which of the features are species-specific. In higher eukaryotes, regulatory variants dependent on tissue type, developmental state and cell-cycle stage add additional layers of complexity. Hence, it remained unclear how Pol I structurally and functionally adapted to the increased regulatory demands in human cells.
To tackle these questions, an in vitro system for human Pol I was needed. A human cell line was established, carrying an endogenous GFP-tag on the largest subunit RPA1 of Pol I. The modified cell line allowed to track Pol I over the cell cycle and to purify the human enzyme to high purity and quality enabling a structure-function analysis. The predominant configuration of Pol I was shown to be a 13-subunit enzyme including a single-subunit stalk, as present in humans, but not in yeast. In vitro functional assays using a minimal DNA-RNA scaffold showed cleavage and elongation activity for hPol I. Comparing hPol I to its yeast counterpart revealed a reduced proof-reading activity on the human enzyme due to a reduced cleavage and proof-reading activity during nucleotide addition. Using cryogenic Electron Microscopy (cryo-EM), a single-particle reconstruction of monomeric hPol I was obtained at 4.09 Å overall resolution allowing the generation of a molecular model. The architecture of the enzyme is conserved between yeast and human. The reconstruction of monomeric hPol I showed connected density for most of the core polymerase and the RPA49/34 dimerization domain. However, the clamp subdomain, the stalk, the C-ribbon of subunit RPA12, the linker and tWH of subunit RPA49, and the human-specific C-terminal region of subunit RPA34 stayed flexible. Enhanced clamp and stalk flexibility was a divergent feature between yeast and human and might suggest that there is no defined state for this region in monomeric hPol I. The foot domain of subunit RPA1 diverges between yeast and human, comprising an additional domain termed ‘dock II’ in humans. Dock II resembles a truncated HMG-box that we found to be incapable of DNA-binding. In situ modelling, in vitro pulldowns and similarity indicated that dock II may serve as a downstream-transcription factor binding platform. This included the possibility of Top2a recruitment, since re-evaluation of Chromatin Immuno-Precipitation (ChIP) data revealed that Top2a was enriched at the rDNA locus. Interestingly, peaks of high Top2a occupancy overlapped with peaks of the metazoan-specific, six HMG-box-containing transcription factor UBF. Indeed, there was Top2a-UBF interaction in vitro, indicating functional cooperativity.
This thesis not only provides evidence for overall functional and structural conservation throughout evolution, but additionally uncovers organism-specific features.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Transkription von DNA zu RNA ist einer der essentiellen Mechanismen jeder lebenden Zelle und wird in Eukaryoten von mindestens drei verschiedenen nuklearen DNA-abhängigen RNA Polymerasen (Pol) katalysiert. Pol I ist dabei auf einen Promoter spezialisiert und transkribiert nur ein Gen, welches für die 47S Vorläufer-rRNA (ribosomale RNA) codiert. Die daraus generierte RNA wird weiter zu 18S, ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die Transkription von DNA zu RNA ist einer der essentiellen Mechanismen jeder lebenden Zelle und wird in Eukaryoten von mindestens drei verschiedenen nuklearen DNA-abhängigen RNA Polymerasen (Pol) katalysiert. Pol I ist dabei auf einen Promoter spezialisiert und transkribiert nur ein Gen, welches für die 47S Vorläufer-rRNA (ribosomale RNA) codiert. Die daraus generierte RNA wird weiter zu 18S, 5.8S und 28S rRNA prozessiert. Gemeinsam mit 5S rRNA und den ribosomalen Proteinen wird daraus der zelluläre Komplex zur Proteintranslation, das Ribosom, gebildet. Aufgrund ihrer wichtigen Funktion, der Synthese von rRNAs, ist Pol I ein entscheidender Regulator des zellulären Wachstums. Diese Relevanz führt dazu, dass Mutationen und Fehlregulationen dieses Transkriptionssystems zu schweren (neuro-)degenerativen Erkrankungen führen können und mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung stehen. Durch die direkte Korrelation zwischen korrekter Pol I Transkription und menschlicher Gesundheit ist das Pol I System in den letzten Jahren in den Fokus der modernen Medizin gerückt. Aktuell werden erste Medikamente, welche die Pol I Transkription regulieren, entwickelt und getestet. Der Großteil der bisherigen Pol I Forschung wurde im Hefe-System durchgeführt, weshalb detaillierte mechanistische, funktionelle und strukturelle Analysen des menschlichen Enzyms noch gefehlt haben. Das Hauptziel dieser Arbeit war zu untersuchen, welche Mechanismen und Eigenschaften der Hefe Pol I auf das menschliche Enzym übertragen werden können und welche spezifisch für die jeweilige Art sind. Außerdem vervielfacht sich in höheren Eukaryoten, wie dem Menschen, die Komplexität, da das Pol I System zusätzlich je nach Gewebetyp, Entwicklungsstatus und Zellzyklus-Phase reguliert werden muss. Deshalb wurden die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des menschlichen Enzyms näher untersucht, um herauszufinden, welche Anpassungen an die vielschichtigen Anforderungen stattgefunden haben.
Um diese Fragen beantworten zu können, musste zunächst ein System etabliert werden, welches die in vitro Analysen und die Aufreinigung von humaner Pol I (hPol I) erlaubt. Dafür wurde zunächst eine humane Zelllinie so verändert, dass die größte Untereinheit der Polymerase RPA1 einen GFP (green flourescent protein)-Tag trägt. Dadurch konnte zum einen das humane Enzym in Zellen visualisiert und im Verlauf des Zellzyklus beobachtet werden, zum anderen konnte hPol I mit hoher Qualität und Reinheitsgrad aufgereinigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die vorherrschende Zusammenstellung von Pol I aus 13 Untereinheiten besteht und der Stalk nur von einer einzelnen Untereinheit gebildet wird, was auch auf das menschliche Enzym zutrifft, allerdings nicht im Hefe-Modellorganismus. Funktionsanalysen zeigten hPol I Aktivität, sowohl bei Spaltung (cleavage) und Elongation. Vergleicht man diese Aktivität mit derjenigen von Pol I aus Hefe, konnte eine verringerte Korrekturleseaktivität (proof-reading) des menschlichen Enzyms erkannt werden, welche sich auf die reduzierte Spaltungsaktivität und/oder auf einen erhöhten tolerierten Einbau falscher Nukleotide zurückführen lässt. Mithilfe der Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM) konnte die Dichte von hPol I im monomeren Zustand mit einer Auflösung von 4.09 Å bestimmt und das Modell erstellt werden. Damit konnte gezeigt werden, dass die allgemeine Architektur zwischen Hefe und Mensch konserviert ist. Die Rekonstruktion der menschlichen Pol I besteht aus zusammenhängender Dichte für die Kern-Polymerase (core polymerase) sowie der RPA49/34 Dimerisierungsdomäne. Dennoch waren einige Domänen flexibel und daher unsichtbar: die Clamp-Domäne, der Stalk, der C-ribbon der Untereinheit RPA12, der Linker und die tWH von RPA49, sowie die C-terminale Region von RPA34. Die Flexibilität der menschlichen Clamp und Stalk Regionen war im Unterschied zur Hefe Pol I deutlich stärker ausgeprägt, was auf eine fehlende definierte räumliche Lage dieser Regionen im monomeren Zustand hinweisen könnte. Ein weiterer Unterschied der humanen Pol I im Gegensatz zur Hefe ist eine zusätzliche Domäne im Foot der Untereinheit RPA1, welche als Dock II bezeichnet wurde. Dock II ähnelt einer HMG-box und ist nicht DNA-bindend. In situ Modellierungen, in vitro Pulldowns and Ähnlichkeiten weisen darauf hin, dass diese Metazoa-spezifische Domäne möglicherweise eine zusätzliche Plattform für die Bindung von Transkriptionsfaktoren sein könnte, wie beispielsweise der Topoisomerase 2a (Top2a). Weitergehende Analysen bereits veröffentlichter Chromatin Immuno-Präzipitation (ChIP) Daten zeigten, dass Top2a tatsächlich am rDNA-Lokus angereichert ist. Interessanterweise konnte dabei auch festgestellt werden, dass einige Stellen erhöhter lokaler Top2a Konzentration mit erhöhter Binding des Metazoa-spezifischen und sechs HMG-Boxen umfassenden Transkriptionsfaktor UBF überlappen. In vitro Untersuchungen konnten zeigen, dass eine direkte Interaktion der beiden Proteine Top2a und UBF möglich ist, was auf eine funktionelle Kooperativität hindeutet.
Diese Arbeit bietet somit nicht nur Einblicke in die funktionelle und strukturelle Konservierung im Verlauf der Evolution, sondern auch in die spezifischen Eigenschaften der verschiedenen Organismen.
Metadaten zuletzt geändert: 31 Mrz 2025 07:40
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