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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-584812
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.58481
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 26 Juni 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Christoph A. Klein |
| Tag der Prüfung: | 26 Juni 2024 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren |
| Stichwörter / Keywords: | Leptomeningeale Metastasierung, disseminierte Tumorzellen, Flüssigkeitsbiopsie, molekulare Liquoranalyse, leptomeningeal metastases, disseminated cancer cells, liquid biopsy, molecular liquor analysis |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 600 Technik 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 58481 |
Zusammenfassung (Englisch)
Tumor cells that are detected in the cerebrospinal fluid or the membranes surrounding the brain and spinal cord (meninges), or both, are referred to as leptomeningeal metastases (LM). They are characterized as a serious complication of advanced cancer, can lead to drastic neurological symptoms and occur in 5-10% of patients with solid tumors. Breast cancer, lung cancer and melanoma are the most ...
Zusammenfassung (Englisch)
Tumor cells that are detected in the cerebrospinal fluid or the membranes surrounding the brain and spinal cord (meninges), or both, are referred to as leptomeningeal metastases (LM). They are characterized as a serious complication of advanced cancer, can lead to drastic neurological symptoms and occur in 5-10% of patients with solid tumors. Breast cancer, lung cancer and melanoma are the most common associated diseases, but cases with an unknown primary tumor (cancer of unknown primary (CUP) syndrome) can also be affected. LM are rare but aggressive in nature and have limited treatment options and an unfavorable central nervous system (CNS) location, which is associated with an unfavorable prognosis and difficult therapeutic decision-making. The diagnosis of LM relies mainly on CSF cytology and magnetic resonance imaging (MRI) evaluation, both of which are the current gold standard in diagnosis, and, where available, information on the primary tumor. As the latter is not always accessible and CSF cytology and magnetic resonance therapy (MRI) have a low sensitivity, the results of which are of a purely quantitative nature, a molecular approach for CSF fluid biopsy was developed in this study, which should make it easier to predict treatment for affected patients in the future.
In a monocentric feasibility study, a qualitative comparison between CSF cytology, MRI data and molecular liquid biopsy results of adult patients with suspected LM and different primary tumors was performed. Disseminated cancer cells (DCCs), cell-free tumor DNA (ctDNA) and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue were molecularly characterized. The results were used to answer the following three questions:
(i) Does molecular fluid biopsy of CSF provide comparable results to the current clinical gold standard, currently CSF cytology and MRI, for patients with suspected LM?
ii) Is the isolation of single cells from CSF a valuable option to provide relevant molecular data and how reliable are these results compared to the analysis of circulating cell-free tumor DNA from CSF in terms of quality, significance and applicability?
iii) Does the heterogeneous landscape of tumor and metastatic tissue indicate the sedimentation of specific subclones colonizing the CNS?
In the first, technical part of this work, a molecular diagnostic workflow was established and optimized with the aim of detecting, enriching and isolating DCCs in CSF. Depending on the underlying primary tumor and its associated expression markers, it was evaluated whether cells could be detected either with the FDA (U.S. Food and Drug Administration) approved CellSearch® technology, based on the EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) expression pattern and cytokeratin staining of carcinoma cells, or by density gradient centrifugation followed by specific fluorescence staining for melanoma cells. These results served to validate the CellSearch® method for CSF in this population in comparison with simultaneous cytological analyses and associated MRI data. The great advantage of this detection method is the ability to identify and isolate individual cells after cell enrichment based on their specific staining. This possibility was used to build up a single cell collective obtained from the CSF for subsequent molecular analysis.
Two different isolation methods were evaluated and the differences in DNA quality depending on the origin of the cell and the technical reprocessing were assessed: The manual method of fluorescence microscopy and automated isolation using DEPArrayTM technology. The categorization of DNA quality served as an additional tool to differentiate between low and high quality samples, with the latter being used for further molecular analyses. Whole genome sequencing was used to determine allele frequencies, which made it possible to determine the origin of the sample and to investigate subclonal diversity within different isolated CSF single cells. In addition to the tumor cells, circulating tumor DNA was also isolated from the CSF. Based on these samples, the workflow for the extraction of cell-free DNA was optimized, a new amplification strategy was tested and validated. The molecular data from these samples were then used to determine whether the enriched DNA was tumor DNA or not and whether the molecular data matched the data from the isolated DCCs.
The advantages and disadvantages of the two biomarkers in the CNS were compared in terms of quality, informative value, applicability and reliability. The analysis of the tumor tissue of the patients included in the study made it possible to investigate intratumoral heterogeneity. For this purpose, tumor and stromal cell populations were isolated from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue to validate the technical feasibility of the DEPArrayTM technology and to optimize the extraction protocol for different tumor types and materials. After the isolation process, the cell populations were analyzed at the molecular level and the data isolated from non-CNS or CNS tissue was compared with data from CSF isolated DNA.
This work has shown that the CSF single cell analysis approach provides comparable results to conventional CSF cytology and, together with MRI, can therefore represent a more sensitive alternative to the current clinical gold standard. A major advantage is the possibility of isolating high-quality cells and subsequently characterizing them at the molecular level. This means that CSF could also be a valuable source for the cultivation and functional analysis of vital cells, which can be used to detect clinically relevant, tumor-specific information that could contribute to the decision-making process for suitable therapy in the future. A fast and cost-effective method of analyzing tumor DNA is the isolation of ctDNA from cerebrospinal fluid. However, the reliability and informative value of this biomarker is significantly lower compared to single cell analysis within this collective. An analysis of both CSF biomarkers can be a practicable solution to quickly obtain initial information from ctDNA and, based on this, to follow up with a more in-depth molecular analysis of the individual cells.
The fact that the genetic profile of cells that sediment into the CNS is clearly different from cells isolated from the visceral area of the affected person highlights the importance of molecular analysis of CSF DNA. This enables the detection of possible CNS-specific markers for individual therapeutic approaches that would remain undetected without the analysis of CSF.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Tumorzellen, welche im Liquor oder den Membranen, die Gehirn und Rückenmark (Meningen) umgeben, oder in beidem detektiert werden, werden als leptomeningeale Metastasen (LM) bezeichnet. Sie sind als schwerwiegende Komplikation einer fortgeschrittenen Krebserkrankungen charakterisiert, können zu einschneidenden neurologischen Symptomen führen und treten bei 5-10 % der Patientinnen und Patienten mit ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Tumorzellen, welche im Liquor oder den Membranen, die Gehirn und Rückenmark (Meningen) umgeben, oder in beidem detektiert werden, werden als leptomeningeale Metastasen (LM) bezeichnet. Sie sind als schwerwiegende Komplikation einer fortgeschrittenen Krebserkrankungen charakterisiert, können zu einschneidenden neurologischen Symptomen führen und treten bei 5-10 % der Patientinnen und Patienten mit soliden Tumoren auf. Brustkrebs, Lungenkrebs und Melanome sind die häufigsten damit verbundenen Erkrankungen, jedoch können auch Fälle mit unbekanntem Primärtumor (Cancer of unknown primary (CUP)-Syndrom) betroffen sein. LM treten eher selten auf, sind aber von aggressiver Natur und weisen begrenzte Behandlungsmöglichkeiten und eine ungünstige Lage im zentralen Nervensystem (ZNS) auf, was mit einer ungünstigen Prognose und einer erschwerten therapeutischen Entscheidungsfindung einhergeht. Die Diagnose von LM stützt sich hauptsächlich auf die Zytologie des Liquors sowie die Auswertung der Magnetresonanztherapie (MRT), beides der aktuelle Goldstandard in der Diagnostik, und, soweit vorhanden, Informationen zum Primärtumor. Da Letztere nicht immer zugänglich sind und Liquorzytologie und Magnetresonanztherapie (MRT) eine geringe Sensitivität aufweisen, derer Aussagen rein quantitativer Natur sind, wurde in dieserArbeit ein molekularer Ansatz für die Liquorflüssigkeitsbiopsie entwickelt, welcher in Zukunft die Therapievorhersage für betroffene Patientinnen und Patienten erleichtern soll.
In einer monozentrischen Machbarkeitsstudie wurde dahingehend ein qualitativer Vergleich zwischen Liquorzytologie, MRT-Daten und molekularen Flüssigbiopsie- Ergebnissen erwachsener Betroffener mit Verdacht auf LM und unterschiedlichen Primärtumoren durchgeführt. Dafür wurden disseminierte Krebszellen (DCCs), zellfreie Tumor-DNA (ctDNA) und Formalin fixiertes in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe, molekular charakterisiert. Mit Hilfe der Ergebnisse sollten folgende drei Fragen beantwortet werden:
i) Liefert die molekulare Flüssigkeitsbiopsie von Liquor vergleichbare Ergebnisse zum aktuellen klinischen Goldstandard, derzeit Liquorzytologie und MRT, für Patientinnen und Patienten mit Verdacht auf LM?
ii) Ist die Isolierung einzelner Zellen aus dem Liquor eine wertvolle Option zur Bereitstellung relevanter molekularer Daten und wie zuverlässig sind diese Ergebnisse im Vergleich zur Analyse zirkulierender zellfreier Tumor-DNA aus Liquor hinsichtlich Qualität, Aussagekraft und Anwendbarkeit?
iii) Gibt die heterogene Landschaft von Tumor- und Metastasengewebe einen Hinweis auf die Sedimentation spezifischer Subklone, welche das ZNS besiedeln?
Im ersten, technischen Teil, dieser Arbeit wurde ein molekularer diagnostischer Workflow etabliert und optimiert, der darauf abzielte, DCCs im Liquor zu detektieren, anzureichern und zu isolieren. In Abhängigkeit des zugrundeliegenden Primärtumors und dessen assoziierten Expressionsmarkern wurde evaluiert, ob Zellen entweder mit der von der FDA (U.S. Food and Drug Administration) zugelassenen CellSearch®- Technologie, auf Basis des EpCAM-Expressionsmusters (Epitheliales Zelladhäsions Molekül) und der Cytokeratin-Färbung von Karzinomzellen, oder mittels einer Dichtegradientenzentrifugation, gefolgt von spezifischer Fluoreszenzfärbung für Melanomzellen, detektiert werden können. Diese Ergebnisse dienten im Vergleich zu simultan durchgeführten zytologischen Analysen und zugehörigen MRT-Daten dazu, die CellSearch® Methode für Liquor in diesem Kollektiv zu validieren. Der große Vorteil dieser Detektionsmethode ist es, einzelne Zellen nach der Zellanreicherung anhand ihrer spezifischen Färbung zu erkennen und zu isolieren. Diese Möglichkeit wurde genutzt, um ein aus dem Liquor gewonnenes Einzelzellkollektiv für die anschließende Molekularanalyse aufzubauen. Hierbei konnten zwei unterschiedliche Isolationsmethoden evaluiert und die Unterschiede in der DNA-Qualität abhängig von der Herkunft der Zelle und der technischen Wiederaufbereitung bewertet werden: Die manuelle Methode der Fluoreszenzmikroskopie und die automatisierte Isolierung mit der DEPArrayTM-Technologie. Die Kategorisierung der DNA-Qualität diente dabei als zusätzliches Instrument zur Unterscheidung von Proben geringer und hoher Qualität, wobei Letztere für weiterführende molekulare Analysen eingesetzt wurden. Durch die Sequenzierung des gesamten Genoms wurden die Allelfrequenzen ermittelt, die es ermöglichten, den Ursprung der Probe zu bestimmen und die subklonale Diversität innerhalb verschiedener isolierter Liquor Einzelzellen zu untersuchen. Darüber hinaus wurde neben den Tumorzellen zusätzlich zirkulierende Tumor-DNA aus dem Liquor isoliert. Anhand dieser Proben wurde der Workflow für die Extraktion von zellfreier DNA optimiert, eine neue Amplifikationsstrategie getestet und diese validiert. Die molekularen Daten dieser Proben wurden anschließend genutzt, um nachzuweisen, ob es sich bei der angereicherten DNA um Tumor-DNA handelt oder nicht und ob die molekularen Daten mit den Daten der isolierten DCCs übereinstimmen. Hier konnten die Vor- und Nachteile der beiden Biomarker im ZNS bezüglich Qualität, Aussagekraft, Anwendbarkeit und Zuverlässigkeit gegenübergestellt werden. Die Analyse des Tumorgewebes der in der Studie inkludierten Patientinnen und Patienten ermöglichte die Untersuchung der intratumoralen Heterogenität. Hierfür wurden Tumor- und Stromazellpopulationen aus Formalin fixiertem in Paraffin eingebettetem (FFPE) Gewebe isoliert, um zum einen die technische Machbarkeit der DEPArrayTMTechnologie zu validieren und zum anderen das Extraktionsprotokoll für verschiedene Tumorarten und -materialien zu optimieren. Nach dem Isolationsprozess wurden die Zellpopulationen auf molekularer Ebene analysiert und die aus nicht-ZNS- oder ZNSGewebe isolierten Daten mit Daten aus Liquor isolierter DNA verglichen.
Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Ansatz der Liquor-Einzelzellanalyse vergleichbare Ergebnisse zur konventionellen Liquorzytologie liefert und damit gemeinsam mit dem MRT eine sensitivere Alternative zum aktuellen klinischen Goldstandard darstellen kann. Ein wesentlicher Vorteil ist die Möglichkeit, qualitativ hochwertige Zellen zu isolieren und anschließend auf molekularer Ebene zu charakterisieren. Damit könnte Liquor auch eine wertvolle Quelle für die Kultivierung und funktionelle Analyse vitaler Zellen sein anhand derer klinisch relevante, tumorspezifische Informationen detektiert werden können, die perspektivisch zur Entscheidungsfindung einer geeigneten Therapie beitragen können. Eine schnelle und kostengünstige Methode der Analyse von Tumor-DNA ist die Isolierung von ctDNA aus Liquor. Die Zuverlässigkeit und Aussagekraft dieses Biomarkers ist gegenüber der Einzelzellanalyse innerhalb dieses Kollektivs jedoch deutlich geringer. Eine Analyse beider Liquor Biomarker kann eine praktikable Lösung sein, schnell erste Informationen aus ctDNA zu erhalten und darauf basierend eine tiefergehende molekulare Analyse der Einzelzellen anzuschließen. Die Tatsache, dass sich das genetische Profil von Zellen, die in das ZNS sedimentieren, eindeutig von Zellen unterscheiden, die aus dem viszeralen Bereich der Betroffenen isoliert wurden, macht die Wichtigkeit der molekularen Analyse von Liquor-DNA deutlich. Damit können mögliche ZNS spezifische Marker für individuelle Therapieansätze detektiert werden, die ohne die Analyse von Liquor unentdeckt bleiben würden.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Jun 2025 08:19
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