Untersuchung zur Bedeutung der USP3-abhängigen Histon-Deubiquitinierung in humanen Gliomen

Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	21 Oktober 2024
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Markus J. Riemenschneider
Tag der Prüfung:	25 September 2024
Institutionen:	Medizin > Abteilung für Neuropathologie
Stichwörter / Keywords:	USP3;DNA-damage response;high-grade gliomas;histone H2A;deubiquitination;epigenetic regulation
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	59398

Zusammenfassung (Deutsch)

Höhergradige Gliome stellen aufgrund ihrer nach wie vor schlechten Prognose eine Herausforderung in der neuroonkologischen Therapie dar. Mit zunehmender Bedeutung molekularpathologischer Aspekte in der WHO-Klassifikation und der Gliomtherapie rücken auch epigenetische Veränderungen und die beteiligten Enzyme weiter in den Fokus aktueller Forschung. Eine weitverbreitete posttranslationale ...

Zusammenfassung (Deutsch)

Höhergradige Gliome stellen aufgrund ihrer nach wie vor schlechten Prognose eine Herausforderung in der neuroonkologischen Therapie dar. Mit zunehmender Bedeutung molekularpathologischer Aspekte in der WHO-Klassifikation und der Gliomtherapie rücken auch epigenetische Veränderungen und die beteiligten Enzyme weiter in den Fokus aktueller Forschung. Eine weitverbreitete posttranslationale Modifikation ist die Ubiquitinierung. Diese nimmt regulatorische Funktionen in zentralen zellbiologischen Prozessen wie Proliferation, Apoptose, Genexpression und DNA-Reparatur ein, die für maligne Entartung und Tumorbiologie von Relevanz sind. Im Zuge dessen wurden auch die Deubiquitinasen als Vermittler der Reversibilität von Ubiquitinierungssignalen in unterschiedlichen Tumorentitäten mit der Krebsentstehung assoziiert, unter anderem die Deubiquitinase USP3. Institutsinterne Analysen von TCGA-Expressionsdaten zeigen ein erhöhtes Vorkommen von USP3 in Gliomen und weisen auf eine mögliche Assoziation mit dem IDH-Mutationsstatus hin.
Ziel dieser Arbeit ist es, die Rolle von USP3 in höhergradigen humanen Gliomen als Deubiquitinase des Histons H2A zu erforschen. Hierzu wurde zunächst die USP3-Expression in Gliomzelllinien sowie das Vorkommen in Tumorgewebeschnitten untersucht. Die Funktion als Deubiquitinase wurde mittels Bestimmung der H2A-Ubiquitinierung nach Überexpression und Knockdown in ausgewählten Gliomzelllinien überprüft. Im Anschluss erfolgten funktionelle Untersuchungen sowie NGS-Analysen auf mRNA-Ebene.
Es konnte in den sechs untersuchten klassischen Gliomzelllinien eine um 1,2- bis 4,5-fach erhöhte USP3-Expression gegenüber Normalhirngewebe festgestellt werden. Auch in Tumorschnitten höhergradiger Gliome von Erkrankten war USP3 immunhistochemisch signifikant vermehrt nachzuweisen. Zusätzlich zeigte sich bei IDH-mutierten Tumoren gegenüber dem IDH-Wildtyp ein stärkeres USP3-Signal im Zellkern. Weiterhin wurde mittels siRNA- und Plasmidtransfektion ein Zellkulturmodell mit reproduzierbarem Knockdown und Überexpression auf RNA- und Proteinebene in den Zelllinien U251 und LN18 etabliert. Durch den Nachweis der gegenläufig regulierten H2A-Ubiquitinierung in Western Blots von Histonextrakten konnte USP3 als Deubiquitinase des Histons H2A auch in humanen Gliomzellen bestätigt werden. Die funktionellen Untersuchungen erbrachten Ergebnisse hinsichtlich einer möglichen kritischen Funktion von USP3 in den Abläufen der zellulären DNA-Reparatur. Bei Induktion von DNA-Schäden durch Behandlung mit aufsteigenden Lomustinkonzentrationen zeigte sich in LN18 nach USP3-Knockdown verglichen mit den Kontrollzellen ein schnellerer und ausgeprägterer Anstieg des DNA-Schadensmarkers γH2AX. Resultierende Effekte auf die Chemosensitivität gegenüber Lomustin waren bei Betrachtung der Zellvitalität jedoch nicht festzustellen. In den weiteren Untersuchungen tumorassoziierter Prozesse zeigten veränderte USP3-Spiegel unter den Bedingungen dieser Arbeit keinen Einfluss auf Proliferation, Apoptose und das Transkriptom.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Doktorarbeit auf eine Beteiligung der Deubiquitinase USP3 in der zellulären Antwort auf Erbgutschäden in höhergradigen humanen Gliomen hin. Die beobachtete Akkumulation von DNA-Schäden nach Behandlung mit Alkylanzien und bei gleichzeitigem Vorliegen einer USP3-Mangelsituation kann auf eine gestörte Modulation des regulatorischen Ubiquitinierungsmusters in den Signalwegen der DNA-Reparatur zurückzuführen sein. USP3 könnte somit nicht nur in der Gliomgenese, sondern auch hinsichtlich des klinischen Therapieansprechens eine Relevanz zukommen, was durch die Assoziation mit der prognostisch günstigen IDH-Mutation gestützt wird.

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

High-grade gliomas present a significant challenge in neuro-oncological therapy due to their poor prognosis. As the WHO CNS classifications increasingly incorporate molecular markers, genetic and epigenetic alterations have come into even greater focus as potential therapeutic targets in brain cancer studies in recent years. This work explores the role of USP3 (ubiquitin-specific peptidase 3) as ...

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

High-grade gliomas present a significant challenge in neuro-oncological therapy due to their poor prognosis. As the WHO CNS classifications increasingly incorporate molecular markers, genetic and epigenetic alterations have come into even greater focus as potential therapeutic targets in brain cancer studies in recent years.
This work explores the role of USP3 (ubiquitin-specific peptidase 3) as a deubiquitinase of histone H2A in high-grade gliomas. USP3 expression was examined in glioma cell lines via real-time PCR and in tumor tissue sections via immunohistochemistry. Following the establishment of a cell culture model in LN18 and U251 with knockdown and overexpression, functional studies were conducted to assess tumor-associated cellular processes such as proliferation, apoptosis, and DNA damage repair. In addition, whole transcriptome RNA sequencing was performed.
The results revealed elevated USP3 levels in glioma cell lines and tumor tissues. Additionally, there was a tendency toward an association of USP3 expression and IDH1 mutation status, indicated by enhanced immunohistochemical staining in the nuclei of IDH1-mutated tumors. Furthermore, USP3 was confirmed as a deubiquitinase of histone H2A in glioma cells using acidic histone extraction and Western blot analysis. Notably, in the assay to examine the function of USP3 in the DNA damage response, USP3 knockdown in LN18 cells resulted in a greater increase in the DNA damage marker γH2AX following treatment with the alkylating agent lomustine. Overall, these findings suggest that USP3 plays a vital role in human high-grade gliomas through critical functions in DNA repair.

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