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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-595985
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.59598
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 12 November 2025 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener and Prof. Dr. Max Keller and Prof. Dr. Ursula Storch |
| Date of exam: | 31 October 2024 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | GPCR Signaling, Impedance, Functional Assay, Luminescence, Second Messenger, NanoBiT, Photoswitchable Ligand, Photochromic Ligand, Photopharmacology |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 59598 |
Abstract (English)
A large number of functional assays to characterize G protein-coupled receptor (GPCR) signaling is based on the readout of a single time point and does not consider signaling dynamics. In addition, many researchers solely orientate on one certain assay format and do not utilize different readout parameters to elucidate the exact molecular mechanisms of GPCR signaling. If two or more functional ...
Abstract (English)
A large number of functional assays to characterize G protein-coupled receptor (GPCR) signaling is based on the readout of a single time point and does not consider signaling dynamics. In addition, many researchers solely orientate on one certain assay format and do not utilize different readout parameters to elucidate the exact molecular mechanisms of GPCR signaling. If two or more functional assays are used, experimental variations need to be taken into account. To tackle these problems, a novel setup for the simultaneous measurement of two functional parameters was developed (chapter 4). Label-free and time-resolved electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) was combined with a kinetic bioluminescence readout of human embryonic kidney (HEK) cells expressing a NanoLuc Binary Technology (NanoBiT) system for the investigation of minimal G protein (miniG, mG) activation. 96W1E+ electrode arrays were electrically contacted in a way that enables simultaneous impedance and bioluminescence measurements inside a commercial 96-well plate reader. First, the cell lines HEK M1R/mGq, HEK M5R/mGq and HEK H2R/mGs were characterized in individual impedance and luminescence measurements using the receptor agonists carbachol, iperoxo (M1R and M5R) and histamine (H2R). Based on the model cell line HEK M1R/mGq, the following assay parameters were optimized: (a) coating of the culture substrate to enhance cellular adhesion, (b) stability and concentration of the luciferin coelenterazine h, (c) the impact of the seeding density, (d) the assay buffer, (e) the reflectivity of the culture substrate, (f) the integration time and optical gain and (g) the cultivation time. With the optimized parameters in hand, all three cell lines were investigated in the dual luminescence-impedance setup. The results indicate that time-resolved and correlated data of one single cell population enable greater insights into the underlying molecular mechanisms of GPCR activation. Additionally, the recorded impedance data is more sensitive for small agonist concentrations, while luminescence displayed a higher sensitivity for large agonist concentrations, where impedance already saturates. The combination of a distal and proximal readout for one and the same cell population is a novel approach that should be considered in future work to clarify the complex signaling machinery of the medically highly relevant GPCRs.
Impedance spectroscopy is a holistic technique and integrates all processes inducing morphological changes and impacting cellular junctions without being molecularly specific. The exact clarification of its underlying mechanisms was part of this work. In chapter 5, the impedance responses of HEK M1R/mGq and HEK H2R cells after stimulation with carbachol and histamine were elucidated by using pathway-specific activators and inhibitors and additional functional assays. For the muscarinic acetylcholine receptor 1 (M1R), not only canonical Gq-coupling was observed but also β-arrestin2 recruitment could be an explanation for the impedance signal after carbachol addition. The canonically Gs-coupled histamine 2 receptor (H2R) also showed calcium ion mobilization (Gq) and β-arrestin2 recruitment after agonist addition. Additionally, impedance measurements of HEK cells (compared to other cell lines, i.e. CHO cells) were insensitive towards intracellular cAMP level changes. To clarify the exact signaling pathways of impedance-based assays, it is of major importance to utilize different independent assays and measurement techniques as well as specific pathway inhibitors and activators.
Photoswitchable ligands can be switched between two isoforms upon illumination with UV or visible light. Ideally, both isomers exhibit different bioactivity and can be switched between a “full on/off” beha ior. his enables better spatiotemporal control of the bioactivity. In chapter 6, two photochromic ligands for the neuropeptide Y4 receptor (Y4R) and the dopamine 2 receptor in its long splicing variant (D2R, D2L) were characterized with impedance measurements. After illumination, CHO cells overexpressing the respective GPCR (CHO D2L or CHO NPY) were incubated with the different ligand isoforms. After determination of the potencies (pEC50) and the optimal switching concentrations, first switching experiments were conducted. Ligand 1 (D2R, D2L) nearly resembled a “full on/off” behavior. Both isoforms of ligand 2 (Y4R) showed individual impedance profiles but not a “full on/off” beha ior. A washing step conducted after ligand incubation and previous to illumination gave mechanistic insights into the switching process of ligand 2. The results suggest that switching occurs within the receptor binding pocket and not by ligand exchange. Overall, the results prove that impedance spectroscopy in combination with photoswitchable ligands is a valuable tool to study GPCR signaling, tune the bioactivity and clarify underlying mechanisms.
Translation of the abstract (German)
Eine Vielzahl funktioneller Assays zur Charakterisierung G Protein gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) basiert auf der Messung eines einzelnen Zeitpunktes und lässt die Kinetik der Signalübertragung unberücksichtigt. Zudem fokussieren sich viele Forschende ausschließlich auf ein Assay Format und ziehen keine weiteren Ausleseparameter heran, um die exakten molekularen Mechanismen der GPCR-Aktivierung ...
Translation of the abstract (German)
Eine Vielzahl funktioneller Assays zur Charakterisierung G Protein gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) basiert auf der Messung eines einzelnen Zeitpunktes und lässt die Kinetik der Signalübertragung unberücksichtigt. Zudem fokussieren sich viele Forschende ausschließlich auf ein Assay Format und ziehen keine weiteren Ausleseparameter heran, um die exakten molekularen Mechanismen der GPCR-Aktivierung aufzuklären. Werden zwei oder mehr funktionelle Assays genutzt, müssen experimentelle Variationen berücksichtigt werden. Um diese Probleme zu überwinden, wurde ein neuartiger, dualer Assay entwickelt mit welchem zwei unterschiedliche funktionelle Parameter simultan gemessen werden können (Kapitel 4). Die Label-freie und zeitaufgelöste Methode Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) wurde mit einem kinetischen Biolumineszenz Assay kombiniert. Mithilfe der NanoLuc Binary Technology (NanoBiT), welche stabil in humane embryonale Nierenzellen (HEK) transfiziert wurde, kann die Aktivierung von minimalen G Proteinen (miniG, mG) luminometrisch erfasst werden. Für den dualen Assay wurden die Elektroden eines 96W1E+ Elektrodenarrays rückseitig elektrisch kontaktiert, so dass eine simultane Detektion von Impedanz und Lumineszenz innerhalb eines kommerziellen Lumineszenz-Plattenlesers möglich war. Zu Beginn wurden die Zelllinien HEK M1R/mGq, HEK M5R/mGq und HEK H2R/mGs in individuellen Impedanz- und Lumineszenz-Messungen charakterisiert. Als Rezeptor Agonisten wurden Carbachol, Iperoxo (M1R, M5R) und Histamin (H2R) eingesetzt. Anhand der Modellzelllinie HEK M1R/mGq wurden für den dualen Assay die folgenden experimentellen Bedingungen optimiert: (a) Substratbeschichtung mit adhäsions-fördernden Proteinen, (b) Stabilität und Konzentration des Luziferins Coelenterazin h, (c) Einfluss der Aussaatdichte, (d) Messpuffer, (e) Reflektivität des Substrates, (f) Integrationszeit und faktorielle Verstärkung der Lumineszenz und (g) Zelldichte. Mit den optimierten Parametern konnten Populationen der drei Zelllinien schließlich erstmalig und quasi-simultan im dualen Impedanz-Lumineszenz-Setup untersucht werden. Die Ergebnisse zeigen, dass zeitaufgelöste und korrelierte Daten einer einzelnen Zellpopulation einen besseren Einblick in die grundlegenden molekularen Mechanismen der GPCR-Aktivierung ermöglichen. Die Impedanz Daten zeigten außerdem eine höhere Sensitivität gegenüber kleineren Agonist Konzentrationen, wohingegen die Biolumineszenz sensitiver gegenüber größeren Konzentrationen ist, bei welchen die Impedanz bereits eine Sättigung vorweist. Die Kombination eines distalen und proximalen Assays für ein und dieselbe Zellpopulation ist ein neuartiger Ansatz, der in Zukunft weiter an Bedeutung gewinnen sollte, um die komplexe Signaltransduktion der medizinisch hochrelevanten GPCRs aufzuklären und die Wirkstoffentwicklung voranzutreiben.
Impedanzspektroskopie ist eine holistische Technik und integriert über alle Prozesse, die zellmorphologische Änderungen induzieren und zelluläre Kontakte beeinflussen, ohne molekulare Spezifität zu besitzen. Die genaue Aufklärung der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen war Teil dieser Arbeit. In Kapitel 5 wurden die Impedanz Profile der Zelllinien HEK M1R/mGq und HEK H2R nach Stimulation mit Carbachol und Histamin entschlüsselt. Dazu wurden sowohl weitere funktionelle Assays als auch Signalweg-spezifische Aktivatoren und Inhibitoren hinzugezogen. Für den muskarinischen Acetylcholin Rezeptor 1 (M1R) konnte gefolgert werden, dass das Impedanz Profil nach Carbachol Zugabe nicht ausschließlich auf einer Signalübertragung auf Gq Proteine, sondern auch auf der Rekrutierung von β-Arrestin2 basiert. Auch für den kanonisch Gs-gekoppelten Histamin 2 Rezeptor (H2R) konnte die Aktivierung weiterer Signalwege (Calcium bzw. Gq, β-Arrestin2) durch den Agonisten nachgewiesen werden. Weiterhin zeigen die Untersuchungen, dass Impedanz-Messungen von HEK-Zellen im Gegensatz zu anderen Zelllinien (wie CHO-Zellen) nicht sensitiv gegenüber Veränderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration sind. Eine eindeutige Aufklärung von Signalwegen über Impedanz-basierte Assays verlangt zwingend die Durchführung unabhängiger funktioneller Assays sowie die Nutzung Signalweg-spezifischer Aktivatoren und Inhibitoren.
Photoschaltbare Liganden verändern nach Belichtung mit UV-Strahlen oder sichtbarem Licht ihre räumliche Anordnung. Üblicherweise lassen sie sich zwischen zwei Isomeren hin- und herschalten. Idealerweise besitzen die beiden Isomere eine unterschiedliche Bioaktivität und können mittels Belichtung zwischen einem vollständigen AN/AUS Zustand wechseln. Dies erlaubt eine bessere lokal und temporär aufgelöste Kontrolle der Aktivierung von GPCRs. In Kapitel 6 wurden zwei photochrome Liganden für den Neuropeptid Y4 Rezeptor (Y4R) und für den Dopamin 2 Rezeptor (D2R, D2L) mittels Impedanz-Messungen charakterisiert. Nach Belichtung wurden CHO-Zellen, die die entsprechenden Rezeptoren überexprimieren (CHO D2L, CHO NPY), mit den verschiedenen Ligand-Isomeren inkubiert. Nach Bestimmung der Potenzen (pEC50) und Ermittlung der optimalen Konzentrationen zum Photoschalten, wurden erste Schaltexperimente durchgeführt. Ligand 1 (D2R, D2L) wies ein nahezu vollständiges AN/AUS Verhalten auf. Beide Isomere des Liganden 2 (Y4R) zeigten individuelle Änderungen des zeitabhängigen Impedanz Profils, ohne jedoch wie ein EIN/AUS-Schalter zu funktionieren. Durch Waschexperimente nach Ligand-Inkubation und vor Belichtung mit Ligand 2 konnten erste mechanistische Einblicke in den Schaltprozess erhalten werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Schaltprozess nicht über einen Ligand Austausch stattfindet, sondern innerhalb der Bindungstasche des GPCRs. Diese Resultate zeigen wie wertvoll und nützlich die Impedanzspektroskopie in Kombination mit photoschaltbaren Molekülen ist, um die Signalübertragung von GPCRs und sogar mechanistische Prozesse auf molekularer Ebene aufzuklären.
Metadata last modified: 12 Nov 2025 07:49
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