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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-764840
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.76484
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 1 August 2025 |
| Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Guido Jürgenliemk |
| Tag der Prüfung: | 21 März 2025 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie (Prof. Heilmann) |
| Stichwörter / Keywords: | Salix; Salix cinerea; flavan-3-ols; proanthocyanidins; phenolics; ICAM-1; in vitro; HCH-catechin; chemotaxonomy; screening; seasonal variability; intersexual variability; inter species variability |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 615 Pharmazie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 76484 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Um das phenolische Inhaltsstoffspektrum in Salix cinerea L. zu charakterisieren, wurden nach einem systematischen Ansatz insgesamt 13 Substanzen isoliert und ihre Strukturen durch spektroskopische Methoden aufgeklärt. Darunter finden sich zwei Salicylalkoholderivate (Salicin, Salicortin), ein Acetophenon-Derivat (Picein), zwei Phenylpropanglycoside (Vimalin, Triandrin), ein Flavanonol ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Um das phenolische Inhaltsstoffspektrum in Salix cinerea L. zu charakterisieren, wurden nach einem systematischen Ansatz insgesamt 13 Substanzen isoliert und ihre Strukturen durch spektroskopische Methoden aufgeklärt. Darunter finden sich zwei Salicylalkoholderivate (Salicin, Salicortin), ein Acetophenon-Derivat (Picein), zwei Phenylpropanglycoside (Vimalin, Triandrin), ein Flavanonol (Dihydromyricetin), zwei Flavan-3-ole (Catechin, Gallocatechin), ein HCH-substituiertes Flavan-3-ol (Catechin-3-O-(1 hydroxy-6-oxo-2-cyclohexen-1-carbonsäure)-ester), zwei dimere Procyanidine (PC B1 und PC B3) sowie zwei dimere Prodelphinidine (Gallocatechin-(4α→8)-Catechin und Gallocatechin-(4α→8)-Gallocatechin). Für das HCH-Catechin sowie die Proanthocyanidine stellt dies den ersten Bericht über eine Isolierung aus S. cinerea dar.
Zudem wurde die Fraktion polymerer Proanthocyanidine in S. cinerea mittels 13C-NMR im Jahresverlauf, zu Beginn, Höhepunkt und Ende der Wachstumsperiode 2019 charakterisiert. Der Polymerisationsgrad stieg während der Wachstumsperiode von durchschnittlich 7 auf 11 Einheiten an, was auf eine saisonale Abhängigkeit hindeutet. Das Verhältnis von 2,3-cis- zu 2,3-trans-konfigurierten Flavan-3-ol Einheiten ist sehr ausgeglichen, wobei nur 2,3-cis-konfigurierte Monomere isoliert werden konnten. Ebenso ausgeglichen ist das Verhältnis von im B-Ring di- und trihydroxylierten Untereinheiten. Dies weist auf einen hohen Anteil von (Epi-)Gallocatechineinheiten im Vergleich zu anderen bereits untersuchten Arten hin. Im Gegensatz zum durchschnittlichen Polymerisierungsgrad bleiben die Verhältnisse der Monomere untereinander im Jahresverlauf konstant. Diese systematische NMR-spektroskopische Untersuchung der Fraktion polymerer Proanthocyanidine der Rinde von Salix cinerea, ist die Erste mit diesem Fokus.
Der pharmakologische Teil dieser Arbeit stellt das mögliche anti-inflammatorische Potenzial des isolierten HCH-Catechins ins Zentrum. HCH-Catechin bewirkte im ICAM-1-Assay ab einer Konzentration von 25 µM eine signifikante Reduktion der TNF-α-induzierten ICAM-1-Expression in vitro. Im Gegensatz dazu zeigte unsubstituiertes Catechin keinen Effekt, ein Ergebnis, welches darauf hindeutet, dass die HCH-Untereinheit für die Aktivität von HCH-Catechin verantwortlich ist. Die Aktivität kann auf die Bildung von Catechol zurückgeführt werden, wie dies in der Literatur bereits für mit HCH-substituierte Salicylalkoholderivate beschrieben ist. Im Rahmen einer kinetischen Untersuchung konnte im Vergleich zu Literaturdaten festgestellt werden, dass HCH-Catechin stabiler ist als Salicylalkoholderivate wie Salicortin und Tremulacin, die unter identischen Zellkulturbedingungen ebenfalls zu Catechol abgebaut werden. Nach 24 Stunden sind unter Assay-Bedingungen noch etwa ein Drittel des HCH-Catechins intakt. HCH-Catechin stellt somit, ähnlich wie Salicylalkoholderivate, eine Quelle für Catechol dar, was in der Qualitätsbewertung von Salicis cortex nicht berücksichtigt wird, da sich diese auf den Gehalt von Salicin stützt. Weitere Studien müssen klären, inwieweit andere Catechol-freisetzende Substanzen in Weidenrinde vorkommen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten zahlreiche potenzielle HCH-Addukte (1-Hydroxy-6-oxo-2-cyclohexen-1-carbonsäure)-ester von Flavan-3-olen in S. cinerea nachgewiesen werden. Diese wurden verteilt über alle proanthocyanidinhaltigen Fraktionen eines methanolischen Extrakts, der mittels Sephadex® LH-20 aufgereinigt wurde, durch LC-MS und LC-MS/MS detektiert. Zudem wurde das Fragmentierungsmuster von Salicylalkoholderivaten und HCH-Addukten von Flavan-3-olen mittels LC-MS/MS verglichen. Es zeigt sich, dass Flavan-3-ole zur Abspaltung der HCH-Seitengruppe als Neutralteilchen neigen, was zu unterschiedlichen charakteristischen Tochterfragmenten im Vergleich zu Salicylalkoholderivaten führt.
Fünf HCH-Addukte von monomeren Flavan-3-olen und Proanthocyanidinen konnten strukturell näher beschrieben und ihr Fragmentierungsmuster postuliert werden. Dies ist der erste detaillierte Bericht über den Fragmentierungsweg di- und trimerer Proanthocyanidin-HCH-Addukte. Zudem wurde erstmalig ein gemischt hydroxyliertes dimeres Proanthocyanidin-HCH-Addukt nachgewiesen. Diese massenspektrometrische Analyse deutet auf die weite Verbreitung von HCH-Addukten in S. cinerea hin und legt den Grundstein für zukünftige Untersuchungen zur Bildung von HCH-Addukten mit weiteren Inhaltsstoffgruppen. Eine Gesamt-HCH-Bestimmung bzw. Quantifizierung Catechol-bildender Strukturen könnte helfen, den Beitrag phenolischer Fraktionen zur Wirksamkeit von Zubereitungen aus Salicis cortex besser zu verstehen.
Das Salix-Screening als vierter Teil der Arbeit befasst sich mit der saisonalen, geschlechtsspezifischen und interspeziellen Variabilität von Sekundärmetaboliten in der Rindendroge von 12 Arten der Gattung Salix. Zur Anwendung kamen drei verschiedene Methoden: Gesamtphenole und Gerbstoffe wurden durch eine Hauptpulverfällung und Phenolreaktion mit Folin-Ciocalteu-Reagenz bestimmt. Proanthocyanidine wurden mit einer UPLC®-DIOL-FLR Methodik nach Polymerisierungsgrad getrennt quantifiziert. Ein UPLC®-RP18-PDA Screening schloss acht phenolische Inhaltsstoffgruppen ein.
Ein zu untersuchender Aspekt war die saisonale Entwicklung der Sekundärmetabolite. Für die Gesamtphenole und insbesondere die Gerbstoffe wurde ein Anstieg im Sommer mit einem anschließenden Abfall nachgewiesen. In der Gruppe der Proanthocyanidine zeigen oligomere und polymere PAs gegensätzliche saisonale Entwicklungen, was auf ein Fließgleichgewicht und eine mögliche Umwandlung der Verbindungen ineinander hindeutet. Das UPLC®-RP18-PDA Screening offenbarte eine große saisonale Variabilität für alle betrachteten Inhaltsstoffgruppen. Aufeinanderfolgende Jahrgänge wiesen in Einzelindividuen ebenso zum Teil deutliche Unterschiede auf. Neben deutlichen interindividuellen, konnten auch interspezielle Variabilitäten nachgewiesen werden.
Ein geschlechtsspezifischer Vergleich in fünf Spezies ergab, dass bei zwei Salix-Arten (S. caprea und S. cinerea) weibliche Individuen signifikant höhere Gehalte an bestimmten phenolischen Inhaltsstoffen aufwiesen. Für eine Spezies (S. fragilis) konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden, während in zwei weiteren Arten (S. daphnoides und S. purpurea) die männlichen Individuen durchweg höhere Gehalte, mit zum Teil signifikanten Unterschieden aufwiesen. Die Hypothese einer "male-biased herbivory", nach der weibliche Individuen mehr in Abwehr von Schädlingen und Fraßfeinden investieren, muss anhand der vorliegenden Ergebnisse in Frage gestellt und als generelle Regel abgelehnt werden.
Eine chemotaxonomische Untersuchung zeigte bei der Betrachtung der Gesamtphenole und Gerbstoffe deutliche Unterschiede zwischen den Sektionen Helix und Vetrix. Die Datenpunkte der Sektion Salix lagen im Scatterplot der Gerbstoffbestimmung zwischen denen der genannten Sektionen Helix und Vetrix. Die Betrachtung des Proanthocyanidinmusters erlaubte die Abgrenzung einzelner Arten des Probensets aufgrund des bevorzugten Polymersierungsgrads. S. caprea, S. caesia und S. hastata konnten deutlich gegen die restlichen Spezies abgegrenzt werden. Zudem konnte eine große Variabilität innerhalb der Sektion Vetirx festgestellt werden. Die Durchführung einer Hauptkomponentenanalyse auf Grundlage von Daten des UPLC®-RP18-PDA Screenings und anschließendes Clustering (DBSCAN) ergab drei große Cluster, basierend auf den Gehalten an Flavan-3-olen, Cumarylalkoholglykosiden und Kaffeesäurederivaten. Mittels hierarchischen Clusterings wurde ein Dendrogramm erstellt, welches etablierten taxonomischen Einteilungen gegenübergestellt wurde. Die Ergebnisse könnten auf eine nötige Neuordnung der Subgenera Vetrix und Salix hindeuten. Insbesondere eine Zusammenführung der Sektionen Hastatae und Daphnella (beide Subgenus Vetrix) mit den Sektionen Subalbae und Salix des Subgenus Salix muss in Betracht gezogen werden. Auch die Forderung einer Ausgliederung von S. caprea in eine eigene Sektion und eine Neuordnung der Sektion Vetrix scheint anhand der vorliegenden Daten legitim. Einschränkend muss jedoch auf die unvollständige Abdeckung des gesamten Genus Salix hingewiesen werden. Eine Korrelation von Flavanonen und Kaffeesäurederivaten sowie von Flavanonolen und Cumarylalkoholglykosiden konnte ebenso nachgewiesen werden. Diese teilt das Probenset in zwei große Gruppen auf und legt einen Zusammenhang mit der Einteilung des Genus Salix in Subgenera nahe. Ob diese Korrelation epigenetische Ursachen hat, muss in weiteren Untersuchungen beleuchtet werden. Dennoch stellt diese Beobachtung einen Startpunkt für detailliertere chemotaxonomische Studien im vielfältigen Genus Salix dar.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In order to characterize the phenolic spectrum in Salix cinerea L., a total of 13 substances were isolated using a systematic approach and their structures were elucidated using a set of spectroscopic methods. The isolates include two salicylic alcohol derivatives (salicin, salicortin), an acetophenone derivative (picein), two phenylpropane glycosides (vimalin, triandrin), a flavanonol ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In order to characterize the phenolic spectrum in Salix cinerea L., a total of 13 substances were isolated using a systematic approach and their structures were elucidated using a set of spectroscopic methods. The isolates include two salicylic alcohol derivatives (salicin, salicortin), an acetophenone derivative (picein), two phenylpropane glycosides (vimalin, triandrin), a flavanonol (dihydromyricetin), two flavan-3-ols (catechin, gallocatechin), an HCH-substituted catechin (catechin-3-O-(1-hydroxy-6-oxo-2-cyclohexene-1-carboxylic acid)-ester), two dimeric procyanidins (PC B1 and PC B3) and two dimeric prodelphinidins (gallocatechin-4α,8-catechin and gallocatechin-4α,8-gallocatechin). For HCH-catechin and the proanthocyanidins, this is the first report of isolation from S. cinerea.
In addition, the fraction of polymeric proanthocyanidins in S. cinerea was characterized by 13C-NMR spectroscopy throughout the year, at the beginning, peak season and end of the 2019 growth period. The degree of polymerization increased from an average of 7 to 11 units during the growth period, indicating a seasonal dependence. The ratio of 2,3-cis- to 2,3-trans-configured units is very balanced, whereby only 2,3-cis-configured monomers could be isolated. The ratio of subunits with di- or trihydroxylated B-rings is balanced. This indicates a high proportion of (epi-)gallocatechin units compared to other species already studied. In contrast to the average degree of polymerization, the ratio within the monomers remains constant over the course of the year. This systematic NMR spectroscopic investigation of the fraction of polymeric proanthocyanidins of the bark of S cinerea is the first with this focus.
The pharmacological part of this work focuses on the possible anti-inflammatory potential of the isolated HCH-catechin. In an ICAM-1 assay, HCH-catechin caused a significant reduction in TNF-α induced ICAM-1 expression at a concentration of 25 µM in vitro. In contrast, unsubstituted catechin showed no effect, a result that indicates that the HCH subunit is responsible for the activity of HCH-catechin. The activity can be attributed to formation of catechol, as previously described in the literature for other HCH substituted salicylic alcohol derivatives. In comparison with literature data, a kinetic study showed that HCH-catechol is more stable than salicylic alcohol derivatives such as salicortin and tremulacin, which are also degraded to catechol under identical cell culture conditions. After 24 hours, about one third of the HCH-catechin is still intact under assay conditions. HCH-catechin thus could represents a source of catechol, similar to salicylic alcohol derivatives, which is not taken into account in the quality assessment of Salicis cortex, as it is focused on salicin content. Further studies are necessary to clarify the extent to which other catechol-releasing substances are present in willow bark.
In the present study, numerous potential HCH adducts of flavan-3-ols were detected in S. cinerea. These were detected by LC-MS and LC-MS/MS distributed over all proanthocyanidin-containing fractions of a methanolic extract purified by Sephadex® LH-20. In addition, the fragmentation pattern of salicylic alcohol derivatives and HCH adducts of flavan-3-ols was compared by LC-MS/MS. It was found that flavan-3-ols tend to cleave off the HCH side group as neutral mass loss, which leads to different characteristic fragments compared to salicylic alcohol derivatives.
Five HCH adducts of monomeric flavan-3-ols and proanthocyanidins were structurally characterized and their fragmentation pattern postulated. This is the first detailed report on the fragmentation pathway of di- and trimeric proanthocyanidin-HCH adducts. In addition, a mixed hydroxylated dimeric proanthocyanidin-HCH adduct was detected for the first time. This mass spectrometric analysis indicates the wide distribution of HCH adducts in S. cinerea and is the foundation for future studies on the formation of HCH adducts with other constituent groups. A total HCH determination or quantification of catechol-forming structures could help to better understand the contribution of phenolic fractions to the efficacy of preparations from Salicis cortex.
The Salix screening as the fourth part of the present study investigates the seasonal, sex-specific and interspecific variability of secondary metabolites in the bark drug of 12 species of the genus Salix. Three different methods were used: total phenols and tannins were determined by a hide powder precipitation and phenol reaction with Folin-Ciocalteu reagent. Proanthocyanidins were separated by degree of polymerization and quantified using a UPLC®-DIOL-FLR method. A UPLC®-RP18-PDA screening included eight phenolic constituent groups.
One aspect to be investigated was the seasonal fluctuation of the secondary metabolites. For the total phenols and especially the tannins, an increase in summer followed by a decrease was detected. The study of proanthocyanidins uncovered that oligomeric and polymeric PAs show opposite seasonal developments, indicating a possible transformation into one another. The UPLC®-RP18-PDA screening revealed a large seasonal variability for all structural classes examined. Successive years also showed significant differences in some individuals. In addition to clear inter-individual variability, interspecific variability was also detected.
A gender-specific comparison in five species showed that in two Salix species (S. caprea and S. cinerea), female individuals had significantly higher levels of certain phenolic constituents. No significant difference was found for one species (S. fragilis), while in two other species (S. daphnoides and S. purpurea) the male individuals consistently showed higher contents, with significant differences in some cases. The hypothesis of a “male-biased herbivory”, according to which female individuals invest more in defense against parasites and herbivores, must be questioned on the basis of the present results and rejected as a general rule.
A chemotaxonomic analysis showed clear differences between the Helix and Vetrix sections when looking at the total phenols and tannins. The data points of the Salix section lay between those of the sections mentioned. The observation of the proanthocyanidin pattern allowed the differentiation of individual species of the sample set based on the preferred degree of polymerization. S. caprea, S. caesia and S. hastata could be clearly distinguished from the remaining species. In addition, a large variability within the Vetirx section was observed. Performing a principal component analysis based on UPLC®-RP18-PDA screening data and subsequent clustering (DBSCAN) revealed three main clusters based on the contents of flavan-3-ols, caffeic alcohol glycosides and caffeic acid derivatives. Using hierarchical clustering, a dendrogram was created which was compared to established taxonomic classifications. The results indicate a necessary reorganization of the subgenera Vetrix and Salix. Merging the sections Hastatae and Daphnella (both subgenus Vetrix) with the sections Subalbae and Salix of the subgenus Salix must be considered. Based on the available data, it also seems legitimate to demand a separation of S. caprea into a separate section and a reorganization of section Vetrix. However, the incomplete coverage of the entire genus Salix in this study must be pointed out. A correlation of flavanones and caffeic acid derivatives as well as of flavanonols and caffeic alcohol glycosides could also be demonstrated. This divides the sample set into two large groups and suggests a connection with the division of the genus Salix into subgenera. Whether this correlation has epigenetic causes must be investigated in further studies. Nevertheless, this observation represents a starting point for more detailed chemotaxonomic studies in the diverse genus Salix.
Metadaten zuletzt geändert: 01 Aug 2025 04:35
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