The neuropeptide Y (NPY) Y4 receptor (Y4R) represents a potential therapeutic target with respect to the treatment of diet-related diseases such as obesity due to its involvement in regulating food intake and gastrointestinal tract motility, among others. Within the family of NPY receptors, the Y4 subtype is one of the least studied. There have been several efforts to develop Y4R ligands, largely with the aim of obtaining potential therapeutics. Given the lack of high-affinity molecular probes that allow for the study of these ligands in vitro under conditions that are physiologically relevant, i.e. using sodium-containing buffers, the new Y4R radioligand [3H]2.5 ([3H]UR-JG102) was characterized in a sodium-containing and, for comparison, also in a sodium-free buffer. The findings from this study showed that [3H]2.5 is suitable for Y4R ligand binding studies under physiological-like conditions (sodium-containing buffer). [3H]2.5 was also used in autoradiographic Y4R binding studies using tissues of rat brain and rat intestines, to assess its suitability for this technique. This study revealed low to moderate expression of Y4R in certain brain regions, including the hypothalamus, midbrain, medulla, and brain stem. Also, Y4R binding of [3H]2.5 was detected in rat intestines, known to express Y4R. These findings suggested that this radioligand is suitable for autoradiographic Y4R binding studies at cryosections of organs.
Another aspect of this thesis focused on identifying the proteolytic enzyme(s) and susceptible amide bond(s) associated with the proteolytic degradation of the cyclic hexapeptide 2.4 (UR-AK86C) (half-life in human plasma ca. 2 h), a potential lead compound for drug development. It also focused on developing plasma-stable analogs of 2.4 with improved stability in human plasma. By Nα-methylation of the proteolytically susceptible amide bond, replacement of the respective amino acids, or elongating the peptide backbone, 13 analogs of 2.4 were synthesized. The study revealed that angiotensin-converting enzyme (ACE), which cleaves the Leu4-Arg5 peptide bond in 2.4, is responsible for the degradation of this peptide in human plasma. Concerning the development of plasma-stable analogs of 2.4, eight peptides with significantly improved plasma stabilities (half-live ≥ 9 h) were obtained. However, the structural changes also led to significant decreases in their Y4R binding affinities and agonism (up to 4 log units) compared to 2.4. Out of these analogs, 4.9b (UR-AG27), containing a cyclopentyl-Gly in position 4 instead of Leu, emerged as a potential lead structure candidate with significantly improved plasma stability (half-life ca. 19.5 h) while exhibiting partial Y4R agonism (cAMP assay: pEC50 = 7.60, Emax = 93%) and moderately high Y4R binding affinity (pKi = 8.58). New analogs of 2.4 and 4.9b were also synthesized, with the guanidine groups in the peptides being replaced by weakly basic methyl-carbamoylguanidine moieties to reduce their positive net charge at pH 7.4, hence potentially increasing their penetration across biological membranes. While the analogs of 2.4 (5.8b (UR-AG13), 5.9b (UR-AG11), and 5.10b (UR-AG15)) showed increased lipophilicity but decreased Y4R binding affinities (up to 1.5 log units), the analog of 4.9b (5.13b (UR-AG41)) exhibited enhanced lipophilicity along with a Y4R binding affinity and agonism similar to 4.9b. Translocation studies of 4.9b and 5.13b using HBEC-5i cells revealed that these analogs were substantially proteolytically degraded by cellular enzymes within 24 h of incubation, producing degradation products similar to those found after their incubation (24 h) in human plasma. Further studies indicated that ACE and its variants were not responsible for their degradation, suggesting a need for additional investigations.
Lastly, part of this thesis focused on elucidating the effect of sodium on the NPY receptor (YR) binding profiles (Y1R, Y2R, Y4R, Y5R) of the endogenous agonists NPY, peptide YY, and pancreatic polypeptide, as well as of selected YR antagonists. The study showed that the presence of sodium generally reduces the binding of agonists to YRs while increasing the binding of antagonists. Notably, the effect of sodium on YR binding was dependent on the receptor subtype and the type of agonist or antagonist studied

Der Neuropeptid Y (NPY) Y4-Rezeptor (Y4R) stellt eine potenzielle therapeutische Zielstruktur in Bezug auf die Behandlung von ernährungsbedingten Krankheiten wie Fettleibigkeit dar, da er unter anderem an der Regulierung der Nahrungsaufnahme und der Motilität des Magen-Darm-Trakts beteiligt ist. Innerhalb der Familie der NPY-Rezeptoren ist der Y4 Subtyp am wenigsten untersucht. Es wurden bzw. werden verschiedene Ansätze verfolgt, Y4R-Liganden zu entwickeln, hauptsächlich mit dem Ziel, potenzielle Therapeutika zu erhalten. Aufgrund des Mangels an hochaffinen markierten Y4R-Liganden, die eine Untersuchung neu entwickelter Y4R-Liganden in vitro unter physiologisch relevanten Bedingungen, d.h. unter Verwendung von natriumhaltigen Puffern, ermöglichen, wurde der neue Y4R-Radioligand [3H]2.5 ([3H]UR-JG102) in einem natriumhaltigen und, zu Vergleichszwecken, in einem natriumfreien Puffer charakterisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass [3H]2.5 für die Bestimmung von Y4R-Bindungsaffinitäten unter Bedingungen, die den physiologischen Zustand nachbilden (natriumhaltiger Puffer), geeignet ist. [3H]2.5 wurde auch in autoradiographischen Y4R-Bindungsstudien unter Verwendung von Rattenhirn- und Rattendarmgewebe verwendet, um seine Eignung für den Nachweis des Y4R in Geweben zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten eine geringe bis moderate Expression des Y4R in bestimmten Hirnregionen, einschließlich des Hypothalamus, des Mittelhirns, der Medulla und des Hirnstamms. Außerdem konnte die zuvor beschriebene Y4R-Expression im Darm von Ratten bestätigt werden. Diese Ergebnisse deuten an, dass [3H]2.5 für autoradiographische Y4R-Bindungsstudien an Kryoschnitten von Organen geeignet ist.
Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit bestand in der Identifizierung der Protease(n) sowie derjenigen Amidbindung(en), die für den proteolytischen Abbau des cyclischen Hexapeptids 2.4 (UR-AK86C) (in vitro Halbwertszeit in humanem Plasma ca. 2 h), einem Y4R-Liganden mit Leitstrukturcharakteristik, verantwortlich sind. Die Experimente zeigten, dass das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE), das die Leu4-Arg5-Peptidbindung in 2.4 spaltet, für den Abbau dieses Peptids in humanem Plasma verantwortlich ist.
Diese Erkenntnis stellte die Grundlage für ein weiteres Teilprojekt dar, welches der Entwicklung von Analoga von 2.4 mit verbesserter Stabilität in humanem Plasma gewidmet war. Durch Nα-Methylierung der Amidbindung zwischen Leu4-Arg5, Austausch der jeweiligen Aminosäuren oder Verlängerung des Peptidrückgrats wurden 13 Analoga von 2.4 synthetisiert. Dabei wurden acht Peptide mit deutlich verbesserten Plasmastabilitäten (Halbwertszeit ≥ 9 h) erhalten. Die strukturellen Veränderungen führten jedoch auch zu einer merklichen Abnahme ihrer Y4R-Bindungsaffinitäten und agonistischen Aktivitäten (bis zu vier log-Einheiten) im Vergleich zu 2.4. Mit einer deutlich verbesserten Plasmastabilität (Halbwertszeit ca. 19,5 h), partiellem Y4R-Agonismus (cAMP-Assay: pEC50 = 7,60, Emax = 93%) und mäßig hoher Y4R-Bindungsaffinität (pKi = 8,58), erwies sich das Peptid 4.9b (UR-AG27), das anstelle von Leu-Cyclopentyl-Gly in Position 4 enthält, als potenzielle Leitstruktur. Anschließend wurden weitere Analoga von 2.4 und 4.9b synthetisiert, wobei die stark basischen Guanidingruppen in den Peptiden durch schwach basische Methylcarbamoylguanidin-Strukturen ersetzt wurden, um ihre positive Nettoladung bei pH 7,4 zu reduzieren und somit möglicherweise die Penetration durch biologische Membranen zu erhöhen. Während die Derivate von 2.4 (5.8b (UR-AG13), 5.9b (UR-AG11) und 5.10b (UR-AG15)) eine erhöhte Lipophilie, aber eine verringerte Y4R-Bindungsaffinität (bis zu 1,5 log-Einheiten) aufwiesen, zeigte das Analogon von 4.9b (5.13b (UR-AG41)) eine erhöhte Lipophilie sowie eine Y4R-Bindungsaffinität und eine agonistische Aktivität ähnlich zu 4.9b. Translokationsstudien von 4.9b und 5.13b mit HBEC-5i-Zellen zeigten, dass diese Peptide innerhalb von 24 Stunden durch Enzyme der verwendeten Zellen zu einem Großteil proteolytisch abgebaut wurden, wodurch Abbauprodukte entstanden, die denen ähnelten, die nach Inkubation (24 Stunden) in humanem Plasma gefunden wurden. Die Ergebnisse nachgestellter Versuche deuteten an, dass ACE und seine Varianten nicht für den Abbau der Peptide in Gegenwart der HBEC-5i-Zellen verantwortlich sind, was weiterer Untersuchungen bedarf.
Schließlich befasste sich ein Teil der Arbeit mit der Wirkung von Natrium auf die NPY-Rezeptor-Bindungsprofile (Y1R, Y2R, Y4R, Y5R) der endogenen Agonisten NPY, Peptid YY und pankreatisches Polypeptid sowie ausgewählter NPY-Rezeptorantagonisten. Die Untersuchungen zeigten, dass Agonisten in Anwesenheit von Natrium im Allgemeinen eine verringerte Y4R-Bindung aufweisen (im Vergleich zum natriumfreien Puffer), während die Bindung von Antagonisten erhöht wird. Interessanterweise war die Höhe des Einflusses von Natrium auf die NPY-Rezeptorbindung wesentlich abhängig vom Rezeptorsubtyp und des verwendeten Agonisten oder Antagonisten.