Der erste Teil dieser Dissertation befasst sich mit dem Einfluss der experimentellen Bedingungen auf die freien Fraktionen (fu) von Antibiotika. Die Bestimmung der freien Serumkonzentrationen erfolgte mittels HPLC und photometrischer Detektion. Um den Einfluss der experimentellen Bedingungen zu erfassen, wurden Zentrifugalbeschleunigung, Temperatur, pH-Wert und die eingesetzten Puffer gezielt variiert und die Ergebnisse mit einem Standardprotokoll (Phosphatpuffer pH 7,4; 37 °C; 1000 × g) verglichen. Bei 10.000 × g ergab sich eine vom Molekulargewicht abhängige Abnahme der freien Fraktion, und bei Raumtemperatur lag die fu insgesamt niedriger als bei 37 °C. In ungepuffertem Serum wurde für saure Substanzen eine höhere freie Fraktion bestimmt, während für basische und amphotere Wirkstoffe im Vergleich zum Standardprotokoll niedrigere Werte ermittelt wurden. Für die meisten Substanzen führte die Verwendung von Phosphat- oder HEPES-Puffer zu vergleichbaren Ergebnissen. Abweichungen traten lediglich bei Wirkstoffen auf, die zur Komplexbildung mit mehrwertigen Ionen neigen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Werts wichtiger ist als eine strikte Temperaturkontrolle. Zusammenfassend konnte in diesem Teil der Dissertation gezeigt werden, dass die freien Serumkonzentrationen von Antibiotika am zuverlässigsten bestimmt werden können, wenn Ultrafilter mit einer hydrophilen Membran aus regenerierter Zellulose verwendet werden, das Serum mit HEPES auf pH 7,4 gepuffert wird und die Zentrifugation bei 37 °C und 1000 × g durchgeführt wird.
Der zweite Teil widmete sich der Entwicklung einer isokratischen HPLC-UV-Methode zur simultanen Bestimmung der freien oder der totalen Konzentrationen von Ceftazidim und Avibactam im Serum. Die entwickelte Methode ist ausreichend sensitiv für die Anwendung im therapeutischen Drug Monitoring (TDM) sowie in pharmakokinetischen Studien. Eine ausreichende Retention des stark polaren Avibactams wurde durch Zugabe von Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (TBA) als Ion-Paar-Reagenz erreicht.

The aim of this dissertation was to assess the impact of experimental conditions on free serum concentrations as determined by ultrafiltration and HPLC-DAD analysis in a wide range of antibiotics. Relative centrifugation force (RCF), temperature, pH, and buffer were varied, and the results were compared with the standard protocol (phosphate buffer pH 7.4, 37 °C, 1000 × g). Generally, at 10.000 × g the unbound fraction (fu) decreased with increasing molecular weight and was lower at 22 °C. In unbuffered serum, the fu of flucloxacillin or valproic acid was increased, whereas that of basic or amphoteric drugs was considerably decreased. Comparable results were obtained using phosphate or HEPES buffer, except for drugs that form metal chelate complexes. The findings demonstrate that maintaining a physiological pH is more important than strictly maintaining body temperature. In conclusion, the results of this work indicate that the determination of free serum concentrations of antibiotics is best achieved using an ultrafiltration device equipped with a hydrophilic regenerated cellulose membrane, buffering the serum to pH 7.4 with HEPES, and centrifugation at 37 °C/1000 × g.
The second part of this work was dedicated to the development of a simple and fast HPLC-UV method for the simultaneous determination of total or free ceftazidime and avibactam in serum, suitable for therapeutic drug monitoring (TDM) or pharmacokinetic studies in humans. Sufficient retention of the very polar avibactam was achieved by adding tetrabutylammonium hydrogen sulfate (TBA) as an ion-pairing agent, allowing the determination of both drugs in serum by isocratic elution.