| License: Publishing license for publications including print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-125520
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12552
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 18 February 2010 |
| Referee: | Prof. Dr. Roland Seifert |
| Date of exam: | 22 January 2010 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmacology and Toxicology (Prof. Schlossmann, formerly Prof. Seifert) |
| Keywords: | Histamin, G-Protein gekoppelter Rezeptor, Radioaktivität, Molekulare Pharmakologie, Funktionelle Selektivität, Proxyfan, Konstitutive Aktivität, Signaltransduktion, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen, Medizinische Chemie, Zielgerichtete Mutagenese; histamine, G protein-coupled receptor, radioactivity, signal transduction, constitutive activity, medicinal chemistry, functional selectivity, proxyfan, protean agonism, molecular pharmacology, site-directed mutagenesis, ligand-receptor interactions |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12552 |
Abstract (English)
The histamine H3 receptor (H3R) is a biogenic amine receptor that belongs to family I of G protein-coupled receptors (GPCRs). During the past two decades, the H3R has gained much interest in academia and industry. The H3Rs is predominantly localized in the brain and regulates the release of histamine as well as other neurotransmitters into the synaptic cleft via negative feedback mechanisms. ...
Abstract (English)
The histamine H3 receptor (H3R) is a biogenic amine receptor that belongs to family I of G protein-coupled receptors (GPCRs). During the past two decades, the H3R has gained
much interest in academia and industry. The H3Rs is predominantly localized in the brain and regulates the release of histamine as well as other neurotransmitters into the synaptic cleft via negative feedback mechanisms. Thus, H3Rs serve as presynaptic auto- or heteroreceptors. H3Rs play an important role in processes like cognition and the sleep-wakecycle. Numerous ligands targeting H3R have been developed as pharmacological tools or potential therapeutics. Some of them show unexpected and pleiotropic effects. The currently available data are not sufficient to explain this uncommon behaviour. The aim of this thesis was to investigate the detailed molecular mechanisms of some
yet unexplained H3R-ligand effects. Therefore, sensitive baculovirus/Sf9 cell-based assay systems to analyze human H3R (hH3R) and rat H3R (rH3R) on a molecular level, were
established. It is known that certain imidazole-containing H3R-ligands like proxyfan are functionally selective, i. e. activate only specific pathways mediated by H3R. In this work, the detailed G protein coupling-profile of H3R was investigated and various imidazole-based ligands were
examined. We did not obtain evidence for differences in the G protein coupling profile of the H3R or functional selectivity of any of the compounds assayed. Possible reasons for the
discrepancies between the results and data obtained from the literature are discussed. These “negative” results cannot be attributed to unsuitability of our expression system for
exclusion of ligand functional selectivity. However, our system is not suitable to definitely exclude protean agonism, a special case of functional selectivity, at H3R, since that would require a systematic and precise variation of receptor-to-G protein stoichiometries. Extensive systematic studies under clearly defined experimental conditions are required to reconcile the discrepancies. Thus, presently, a specific and generally applicable mechanistic explanation for the previously observed pleiotropic effects of proxyfan cannot yet be provided. Additionally, despite a very high sequence homology of hH3R and rH3R, there are substantial pharmacological species differences. Imoproxifan is an inverse agonist at rH3R, but almost full agonist at hH3R. We have shown that hH3R and rH3R expressed in Sf9 cells both couple similarly to defined Gi/Go-protein heterotrimers and display similar constitutive activities. We show species-differences in pharmacological properties of imoproxifan and offer an explanation on the molecular basis for these differences. Most importantly, we introduce novel active state models of hH3R and rH3R that are suitable to explain the efficacy of H3R ligands. Two amino acid residues between hH3R and rH3R cause the reversal in efficacy of imoproxifan due to substantial differences in the electrostatic potential surfaces of the binding pockets. Monovalent ions differentially affect GPCR signalling by as yet poorly understood mechanisms. In particular, Na+ is known as universal allosteric GPCR modulator. However, it is unknown how Na+ - ions exert the effects and whether it is not the counter-ion, which is responsible for the salt effects. Therefore, the H3R was used as a model system to study the effect of various monovalent ions. Moreover, a highly conserved aspartate in TM II, thought to be an interaction site of Na+ - ions in GPCRs, was mutated to asparagine. It turned out that most probably both, cation and anion, exert a modulatory effect on GPCR/G proteincoupling. Monovalent cations may stabilize an inactive H3R-state via interaction with the conserved aspartate in TM II, while anions may increase the affinity of G proteins for GDP and thus, indirectly affect their interaction with H3R. Interestingly, NaCl differentially affects the G protein coupling-profile of H3R. NaCl selectively abolished constitutive signalling of H3R only in the presence of Gαi3. Obviously, the conserved aspartate in TM II is a key residue for H3R/Gαi3 protein-activation. The latter result suggests that H3R/G protein-coupling interfaces may differ even between closely related subunits. In conclusion, this thesis provides new insight into the molecular mechanisms of H3R function, G protein-coupling and species-differences. The availability of a sensitive H3R test system will improve the development of new histamine receptor ligands, especially with respect to selectivity over the structurally related H4R, and contribute to a better understanding of ligand effects. Most importantly, a gap was filled regarding the interaction of H3R with specific G protein α-subunits, an until now insufficiently investigated area.
Translation of the abstract (German)
Der Histamin H3-Rezeptor (H3R) gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Die Klonierung des H3R hat bei Wissenschaftlern im akademischen Bereich und in der Industrie großes Interesse geweckt. Der H3Rs wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert und reguliert die Ausschüttung von Histamin und anderen Neurotransmittern in den synaptischen Spalt über negative ...
Translation of the abstract (German)
Der Histamin H3-Rezeptor (H3R) gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Die Klonierung des H3R hat bei Wissenschaftlern im akademischen Bereich und in der Industrie großes Interesse geweckt. Der H3Rs wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert und reguliert die Ausschüttung von Histamin und anderen Neurotransmittern in den synaptischen Spalt über negative Rückkopplungsmechanismen. H3Rs werden deshalb als präsynaptische Auto- oder auch Heterorezeptoren bezeichnet. H3Rs spielen eine wichtige Rolle bei kognitiven Prozessen und der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus. Viele H3R-Liganden wurden bereits entwickelt, entweder als pharmakologische Werkzeuge oder mögliche Therapeutika. Einige von diesen Substanzen zeigen unerwartete Effekte in verschiedenen pharmakologischen Testsystemen. Anhand bisheriger Daten kann die ungewöhnliche Pharmakologie dieser Verbindungen aber nicht eindeutig erklärt werden. Ziel dieser Arbeit war es, den detaillierten molekularen Aktivierungsmechanismus des H3R näher zu beschreiben. Zu diesem Zweck wurde ein sensitives, auf Bakuloviren und Sf9-Zellen basierendes, Testsystem zur Analyse des humanen H3R (hH3R) und Ratten H3R (rH3R) auf molekularer Ebene, etabliert. Es ist bekannt, dass bestimmte imidazol-haltige H3R-Liganden, wie Proxyfan, funktionell selektiv sind, d. h. nur bestimmte H3R-vermittelte Signalwege aktivieren. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Kopplung des H3R an verschiedene G-Proteine untersucht und eine Reihe von imidazol-haltigen Liganden getestet. Keine der Verbindungen war funktionell selektiv. Mögliche Ursachen für die Diskrepanzen zwischen diesen Ergebnissen und Daten aus der Literatur werden diskutiert. Diese „negativen“ Daten, welche gegen eine funktionelle Selektivität der untersuchten Substanzen sprechen, sind nicht auf das von uns entwickelte Testsystem zurückzuführen. Jedoch kann auf Grundlage dieser Daten „protean agonism“, eine spezielle Form von funktioneller Selektivität, nicht ausgeschlossen werden. Dazu müsste die Rezeptor/G-Protein-Stöchiometrie gezielt und systematisch verändert werden. Aufwändige Studien unter klar definierten experimentellen Bedingungen werden dafür in Zukunft notwendig sein. Zum jetzigen Zeitpunkt gibt es also noch keine zufriedenstellende Erklärung für die ungewöhnliche Pharmakologie von Proxyfan. Trotz einer hohen Sequenzhomologie zwischen hH3R und rH3R gibt es erhebliche pharmakologische Speziesunterschiede. Imoproxifan, ein inverser Agonist am rH3R, ist fast ein voller Agonist am hH3R. Wir konnten zeigen, dass hH3R und rH3R in Sf9-Zellen ähnlich gut an heterotrimere Gi/Go-Proteine koppeln und eine ähnlich hohe konstitutive Aktivität besitzen. Die molekulare Ursache für das Spezies-spezifische Verhalten von Imoproxifan wurde aufgeklärt. Dafür wurden neue und bisher nicht verfügbare Computermodelle des aktiven Zustandes von hH3R und rH3R generiert. Unterschiede in nur zwei Aminosäuren zwischen hH3R und rH3R führen zu den pharmakologischen Unterschieden aufgrund unterschiedlicher elektrostatischer Oberflächenpotentiale der Bindetaschen. Monovalente Ionen beeinflussen die GPCR-Signaltransduktion auf verschiedene Art und Weise. Die zugrunde liegenden Mechanismen werden aber nur wenig verstanden. Natriumionen sind universelle allosterische GPCR-Modulatoren. Wie Natriumionen aber
diese Effekte verursachen, und ob nicht das Gegenion auch eine Rolle spielt, ist bisher allerdings nur unzureichend untersucht. Um sich dem Problem anzunähern, wurde der H3R
als Modellsystem verwendet und die Effekte verschiedener Salze monovalenter Ionen studiert. Zusätzlich wurde ein hochkonserviertes Aspartat in TM II, welches eine potentielle
Interaktionsstelle für Natriumionen in GPCRs darstellt, zu Asparagin mutiert. Aufgrund der vorliegenden Daten wird geschlussfolgert, dass wahrscheinlich sowohl Kationen als auch Anionen die GPCR/G-Proteinkopplung modulieren. Monovalente Kationen stabilisieren einen inaktiven H3R-Zustand über eine Interaktion mit dem konservierten Aspartat in TM II, während Anionen die Affinität von G-Proteinen zu GDP erhöhen und daher indirekt deren Interaktion mit dem H3R beeinflussen. Interessanterweise beeinflusst NaCl die Kopplung des H3R an verschiedene G-Proteine auf unterschiedliche Art und Weise. NaCl unterdrückt selektiv die konstitutive Aktivität des H3R nur in Anwesenheit von Gαi3. Das konservierte Aspartat in TM II spielt bei der H3R/Gαi3-Interaktion eine Schlüsselrolle. Diese Daten suggerieren, dass die H3R/G-Proteininteraktionsflächen unterschiedlich sein müssen, sogar bei sehr nah verwandten Untereinheiten. Zusammenfassend erbrachte diese Dissertation neue Einblicke in den molekularen Aktivierungsmechanismus des H3R und dessen G-Proteinkopplung. Außerdem wurden wichtige Speziesunterschiede auf molekularer Ebene geklärt. Die Verfügbarkeit eines sensitiven und robusten H3R-Testsystems ist eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung neuer selektiver Histamin-Rezeptorliganden, speziell gegenüber dem strukturell verwandten H4R, und zur Erlangung eines besseren Verständnisses von ungewöhnlichen Ligandeneffekten.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 10:42
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