| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (12MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-157237
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.15723
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 7 April 2011 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Tag der Prüfung: | 25 Juni 2010 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Rainer Merkl Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Tryptophan Biosynthese, Sulfolobus solfataricus, TrpC |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 15723 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Indolglycerinphosphat-Synthase aus Sulfolobus solfataricus (sTrpC) ist ein gut charakterisiertes Enzym mit einer (βα)8-barrel Struktur, das den vierten Schritt der Tryptophanbiosynthese katalysiert. Dabei wird 1-(o-Carboxyphenylamino)-1-desoxyribulose 5-phosphat (CdRP) zu Indol-3-glycerinphosphat (IGP) umgesetzt, wobei es zur Freisetzung von Wasser und Kohlendioxid kommt. In früheren ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Indolglycerinphosphat-Synthase aus Sulfolobus solfataricus (sTrpC) ist ein gut charakterisiertes Enzym mit einer (βα)8-barrel Struktur, das den vierten Schritt der Tryptophanbiosynthese katalysiert. Dabei wird 1-(o-Carboxyphenylamino)-1-desoxyribulose 5-phosphat (CdRP) zu Indol-3-glycerinphosphat (IGP) umgesetzt, wobei es zur Freisetzung von Wasser und Kohlendioxid kommt. In früheren Untersuchungen wurden durch Mutationsanalysen die katalytisch essentiellen Reste ermittelt und Röntgenstrukturen von sTrpC mit CdRP, dem Substratanalogon reduziertes CdRP (rCdRP) und IGP aufgeklärt. Auf dieser Basis wurde ein Reaktionsmechanismus mit zwei Intermediaten formuliert. Außerdem konnte die niedrige katalytische Aktivität von sTrpC bei niedrigen Temperaturen durch eine Kombination aus Zufallsmutagenese und Selektion in vivo erhöht werden.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit sollten weitere Reste mit Bedeutung für die Stabilität und Funktion von sTrpC identifiziert werden. Dazu wurden zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt. Zum einen wurde die Struktur von sTrpC mit der von TrpC aus Thermotoga maritima (tmTrpC) überlagert, welches eine deutlich höhere Aktivität und Stabilität besitzt. Auf der Basis dieser Superpositionierung wurden mittels gezielter Mutagenese einige Reste am aktiven Zentrum von sTrpC durch die äquivalenten Reste aus tmTrpC ersetzt. Zum anderen wurden auf der Basis eines bioinformatischen Ansatzes, der auf einem multiplen Sequenzalignment (MSA) sehr vieler TrpC-Sequenzen beruht, potentiell wichtige Reste in sTrpC identifiziert und durch den jeweils im MSA häufigsten ersetzt. Die sTrpC-Mutanten aus beiden Ansätzen wurden in Escherichia coli hergestellt, die rekombinanten Proteine gereinigt und ihre Aktivitäten und thermischen Stabilitäten mit denen des wildtypischen sTrpC (sTrpC-wt) verglichen.
Steady-state kinetische Messungen zeigten, dass sich durch die Mutationen R64F bzw. S181A die Wechselzahl (kcat) von sTrpC leicht erhöhte bzw. stark verringerte, während alle anderen Austausche diesbezüglich nur sehr geringe Auswirkungen hatten. Dagegen führten die meisten der eingeführten Mutationen zu einer mehr oder weniger deutlichen Erhöhung der Michaeliskonstante für CdRP (KMCdRP). Die Ergebnisse sprechen für eine direkte oder indirekte Beteiligung von W8, R54, K55, R64, I133, L142, S181 und F230 an der Substratbindung. Während dies für W8 bekannt war und I133 als wichtig für die Produktbindung eingestuft worden war, war den anderen Resten bisher keine Bedeutung für die Ligandenbindung zugemessen worden.
Thermische Inaktivierung ergab, dass der L187F Austausch zu einer deutlichen Erhöhung und die Mutationen I133A, I133E und 133D zu einer starken Erniedrigung der Halbwertszeit der Inaktivierung bei 75 °C führen. Die restlichen Austausche hatten nur geringe Auswirkungen auf die thermische Stabilität. Sowohl sTrpC-wt, als auch alle untersuchten Mutanten wiesen einen Knick im Arrhenius-Diagramm auf, der jedoch bei recht unterschiedlichen Temperaturen lag. Da Nah-UV und Fern-UV Circulardichroismus keine Hinweise auf temperaturinduzierte Konformationsänderungen von sTrpC-wt erbrachte, ist die beobachtete Nichtlinearität wohl auf eine Änderung des ratenlimitierenden Schrittes der Reaktion zurückzuführen. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieses Teils der Arbeit, dass die direkte Übertragung von Resten aus tmTrpC sich nicht zur Erhöhung der Aktivität und Stabilität von sTrpC eignet. Dagegen führte ein neuer bioinformatischer Ansatz zur Identifizierung wichtiger Reste des Enzyms, deren Bedeutung durch bisherige Analysen der Sequenz und Struktur des Enzyms nicht erkannt worden war.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Reaktionsmechanismus von sTrpC-wt durch pre-steady-state Untersuchungen mittels Stopped-flow Techniken kinetisch analysiert. Bindungsstudien mit dem Substratanalogon rCdRP zeigten, dass zwei unterschiedliche Konformere des Liganden mit verschiedenen Raten an das Enzym binden bzw. von ihm dissoziieren. Der Quotient aus den koffrCdRP und konrCdRP-Raten einer Spezie deckt sich mit der bei Gleichgewichtstitrationen ermittelten Dissoziationskonstante KDrCdRP. Durch Verdrängungsexperimente mit hohen Konzentrationen an Orthophosphat konnte der Wert für die Dissoziationskonstante des Produktes koffIGP ermittelt werden. Die Analyse von Single-turnover (STO) Messungen, bei denen CdRP durch einen Überschuss an sTrpC-wt zu IGP umgesetzt wurde, zeigte einen mehrstufigen Verlauf des beobachteten Fluoreszenzsignals. Die Analyse deutet auf mindestens zwei Intermediate hin und steht somit dem in der Literatur postulierten Mechanismus nicht entgegen. Jede der in den STO-Experimenten ermittelten Ratenkonstanten war jedoch, ebenso wie der durch Verdrängungsexperimente bestimmte koffIGP, deutlich größer als der in steady-state Messungen ermittelte kcat-Wert, weshalb der ratenlimitierende Schritt der Reaktion nicht endgültig identifiziert werden konnte.
Übersetzung der Zusammenfassung (Nicht ausgewählt)
The Indolglycerinphosphate-synthase of Sulfolobus solfataricus (sTrpC) is a well characterized enzyme with a (βα)8-barrel fold, catalysing the fourth step of the tryptophan biosynthesis. In this process 1-(o-Carboxyphenylamino)-1-desoxyribulose 5-phosphate (CdRP) is converted into Indole-3-glycerinphosphat (IGP) under release of water and carbon dioxide. The essential catalytic residues were ...
Übersetzung der Zusammenfassung
The Indolglycerinphosphate-synthase of Sulfolobus solfataricus (sTrpC) is a well characterized enzyme with a (βα)8-barrel fold, catalysing the fourth step of the tryptophan biosynthesis. In this process 1-(o-Carboxyphenylamino)-1-desoxyribulose 5-phosphate (CdRP) is converted into Indole-3-glycerinphosphat (IGP) under release of water and carbon dioxide. The essential catalytic residues were determined in previous studies by mutational analysis and the X-ray structures of sTrpC with CdRP, substrate analogon reduced CdRP (rCdRP) and IGP were solved. Based on this a reaction mechanism with two intermediates was postulated. Furthermore the low catalytic activity at low temperatures of sTrpC could be increased by a combination of directed evolution and in vivo selection.
In the first part of the thesis more residues with importance for stability and function of sTrpC should be identified. For this two different strategies were used. On the one hand the structure of sTrpC was superimposed with TrpC of Thermotoga maritima (tmTrpC), which has a clearly higher activity and stability. Based on this superposition residues at the active site were changed by site-directed mutagenesis to the equivalents in tmTrpC. On the other hand potentially important residues in sTrpC were identified by a bioinformatic approach which is based on a multiple sequence alignment (MSA) existing of many TrpC-sequences and exchanged to the most frequently residue of the MSA. The sTrpC mutants of both approaches were expressed in E. coli. The recombinant proteins were purified and their activities and thermal stabilities were compared with the wildtype sTrpC (sTrpC-wt).
Steady-state kinetic measurements showed that the mutations R64F, S181A, respectively increased the turnover number slightly, respectively decreased it enormously, whereas all other mutations had only very low influences. In contrast most of the introduced mutations lead to a more or less clear increase of the Michaelis constant (KMCdRP). The results argue for a direct or in direct involvement of W8, R54, K55, R64, I133, L142, S181 and F230V in substrate binding. While this was known for W8 and I133 was classified to be important for product binding, the other residues so far were not recognised to be involved in ligand binding.
Thermal inactivation yielded for the mutation L187F in a significant increase and for the mutations I133A, I133D and I133E in an enormous decrease of the half-life of inactivation at 75°C. The remaining exchanges only had little influence on the thermal stability. sTrpC-wt as well as all characterised mutants showed a break in the Arrhenius plot however it was at very different temperatures. Near-UV and far-UV circular dichroism showed no indication for temperature induced conformational change of sTrpC-wt, on account of this the observed non-linearity is caused by a change of the rate-limiting step of the reaction. All together the results of this part show that a direct transfer of residues of tmTrpC is not suited for increasing the activity and stability of sTrpC. In contrast a new bioinformatic approach led to identification of important residues of the enzyme, which meaning has not been recognised by former sequence and structure analysis of the enzyme.
In the second part of the thesis the reaction mechanism of sTrpC-wt was kineticly analysed by pre-steady-state measurements using stopped-flow techniques. Binding studies with the substrate analogon rCdRP showed, that two different conformers of the ligand bind to and dissociate of the enzyme respectively with different rates. The quotient of koffrCdRP and konrCdRP rates of one species coincides with the observed dissoziation constant KDrCdRP of equilibrium titrations. By competition experiments with high concentrations of orthophosphate the dissociation constant of the product IGP could be determined. The analysis of single-turnover (STO) experiments showed a multiphase process of the fluorescence signal, when converting CdRP with a large excess of sTrpC-wt to IGP. The analysis is a hint for at least two intermediates and is not in conflict with the postulated mechanism in the literature. But each of the determined rate constants in the STO-experiments and also the rate constant determined by competition experiments koffIGP is significantly higher than the kcat-value calculated by steady-state measurements, for which reason the rate-limiting step of the reaction could not be identified definitively.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 08:48
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