| License: Publishing license for publications excluding print on demand (26MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-158137
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.15813
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 26 July 2010 |
| Referee: | Prof. Dr. Stephan Schneuwly and Prof. Dr. Michael Rehli |
| Date of exam: | 17 May 2010 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Zoologie > Entwicklungsbiologie (Prof. Dr. Stephan Schneuwly) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Epigenetik, DNA-Methylierung, Tumorsuppressorgene, epigenetics, DNA methylation, tumor |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 15813 |
Abstract (English)
Aberrant DNA methylation of CpG islands (CGIs) is a common alteration during malignant transformation that leads to the abnormal silencing of tumor suppressor genes and plays a role in disease initiation and progression. The major aim of the present thesis was the implementation of methodologies to identify epigenetic marker genes that can be used for the diagnosis as well as for the targeted ...
Abstract (English)
Aberrant DNA methylation of CpG islands (CGIs) is a common alteration during malignant transformation that leads to the abnormal silencing of tumor suppressor genes and plays a role in disease initiation and progression. The major aim of the present thesis was the implementation of methodologies to identify epigenetic marker genes that can be used for the diagnosis as well as for the targeted treatment of tumors. Furthermore, the molecular mechanisms controlling the methylation status of CpG islands in normal and malignant cells should be analyzed. To address these issues, a novel and robust technique, called methyl CpG immunoprecipitation (MCIp) was developed that allows for the unbiased genome-wide profiling of CpG methylation in DNA samples where quantity is limited. This approach is based on a recombinant, antibody-like protein that efficiently binds native CpG methylated DNA and enables the fractionation of DNA fragments depending on the particular methyl-CpG content. This application facilitates the monitoring of CpG island methylation either on single gene or on genome-wide levels. Initial genome-wide methylation profiling of myeloid leukemia cell lines using 12K CpG island microarrays identified over one hundred genes with aberrantly methylated CpG islands. Interestingly, the comparison with gene expression data revealed that more than half of the identified genes were not expressed in various healthy cell types, indicating that hypermethylation in cancer may be largely independent of the transcriptional status of the affected gene. The majority of individually tested genes were also hypermethylated in primary blast cells from AML patients.
The MCIp approach was further optimized and adapted for a more suitable microarray platform (Agilent 244K CGI microarrays). The in-depth comparison of MCIp and MassARRAY for two established cell lines showed an excellent correlation over a set of 140 genes (1,150 amplicons covering approximately 13,500 CpG dinucleotides). In order to identify potential marker genes, global comparative CpG island methylation profiles for more than 25 AML samples (of mostly normal karyotype) and ten patients with colorectal carcinoma using MCIp in combination with microarray were generated. Our comprehensive analysis identified a large array of CGIs that are previously unrecognized targets of hypermethylation in AML. For the identification of potential marker genes, approximately 400 regions were selected based on the array results for screening a large set of 200 AML patients. The data are now ready to be subjected to computational analyses.
In order to get insights into the process regulating the methylation status of CpG islands, factors should be identified that are responsible for maintaining or establishing methylated states of CGIs in health and disease as well as for de novo methylation in cancer. De novo motif discovery analysis revealed two repetitive sequence motifs (GAGA, CACA) that were commonly enriched in CpG islands that were methylated in cancer. More strikingly, the global analysis demonstrated a highly significant association of unmethylated CpG islands with consensus sequences for GA binding protein (GABP), specific protein (Sp) 1 and 3, nuclear respiratory factor (NRF) 1, nuclear factor (NF) Y, yin-yang (YY) 1 and an unknown factor in all analyzed samples. Using ChIP-on-chip assays we also showed that most of the identified motifs for Sp1, NRF1 and YY1 were actually bound by the respective factors in normal cells and that these regions did not acquire de novo methylation in leukemia cells. In addition, the data provide global evidence that the stable binding of any of these transcription factors to their consensus motif depends on their co-occurrence with neighboring consensus motifs. Thus, the results of the present thesis suggest a major role for cooperative transcription factor binding in maintaining the unmethylated status of CpG islands in health and disease. The data also implies that the majority of de novo methylated CpG islands are characterized by the lack of sequence motif combinations and the absence of activating transcription factor binding.
Translation of the abstract (German)
Tumorzellen zeichnen sich häufig durch ein verändertes DNA-Methylierungsmuster aus. Fehlerhafte DNA-Methylierung von CpG-Inseln (CGIs) kann zur abnormen Repression von Tumorsuppressorgenen führen und Tumorwachstum fördern. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, Methoden zu etablieren, um diagnostisch oder therapeutisch verwertbare epigenetische Biomarker zu identifizieren. Desweiteren sollten ...
Translation of the abstract (German)
Tumorzellen zeichnen sich häufig durch ein verändertes DNA-Methylierungsmuster aus. Fehlerhafte DNA-Methylierung von CpG-Inseln (CGIs) kann zur abnormen Repression von Tumorsuppressorgenen führen und Tumorwachstum fördern. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, Methoden zu etablieren, um diagnostisch oder therapeutisch verwertbare epigenetische Biomarker zu identifizieren. Desweiteren sollten die molekularen Mechanismen analysiert werden, die den Methylierungsstatus von CGIs sowohl in gesunden als auch in entarteten Zellen regulieren.
Für den unvoreingenommenen, globalen Nachweis von differentieller genomischer CpG Methylierung wurde eine neuartige Methode, die sogenannte Methyl CpG Immunpräzipitation (MCIp), entwickelt und etabliert. Diese Technologie basiert auf einem rekombinanten Antikörper-ähnlichen Protein, das doppelsträngige, methylierte DNA binden kann und eine Fraktionierung der DNA-Fragmente hinsichtlich ihres Methylierungsgrades ermöglicht. Die Detektion methylierter DNA kann sowohl auf Einzelgenebene als auch genomweit durchgeführt werden. Die ersten genomweiten Methylierungsanalysen von myeloischen Leukämiezelllinien mit 12K CpG-Insel-Mikroarrays führten zur Identifizierung von über einhundert Genen, die in den Zelllinien im Vergleich zu normalen Blutmonozyten von Hypermethylierung betroffen waren. Ein Vergleich mit Expressionsdaten zeigte, dass ein Großteil der methylierten Gene weder in normalen myeloischen Zellen noch in den untersuchten Tumorzellen exprimiert war. Dies könnte darauf hindeuten, dass die tumorspezifische Hypermethylierung unabhängig vom transkriptionellen Status eines Gens ist. Die meisten der getesteten Genfragmente waren auch in primären AML-Blasten hypermethyliert.
Die MCIp-Technik wurde weiter optimiert und auf eine neue und besser geeignete Mikroarray-Plattform angepasst (Agilent 244K CpG-Insel Mikroarrays). Die Validierung der Mikroarraydaten mittels MassARRAY-Technologie (1150 Amplikons aus 140 Genen, welche 13500 CpG Dinukleotide abdeckten) zeigte eine sehr gute Korrelation beider Methoden. Zur Identifizierung von potentiellen Biomarkern wurden globale DNA-Methylierungsprofile einerseits von Blasten aus 25 AML-Patienten mit primär normalem Karyotyp, aber auch von zehn Patienten mit kolorektalem Karzinom erstellt. Unsere Analysen identifizierten eine Reihe von Genen von denen bislang nicht bekannt war, dass sie von Hypermethylierung betroffen sein können. Um relevante Markergene zu identifizieren, wurden ca. 400 Regionen anhand der Arrayergebnisse ausgewählt und in einem größeren Patientenkollektiv (200 AML Proben) mithilfe der MassARRAY-Technologie validiert. Die entsprechenden Daten werden aktuell noch bioinformatischen Analysen unterzogen.
Um Einblick in den Mechanismus zu gewinnen, wie die Methylierung von CpG-Inseln reguliert wird, sollten Faktoren identifiziert werden, welche einen entscheidenden Einfluss bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Methylierungsmustern sowohl in gesunden als auch in Tumorzellen haben. Mittels de novo-Motivanalysen konnte gezeigt werden, dass zwei repetitive Sequenzmotive (GAGA, CACA) häufig in CGIs angereichert waren, welche in Tumorzellen methyliert wurden. Darüber hinaus stellten wir mittels globaler Analysen eine hochsignifikante Assoziation von unmethylierten CGIs mit Konsensussequenzen für GABP (GA binding protein), Sp1 (Specific protein 1), NRF1 (nuclear respiratory factor 1), NFY (nuclear factor Y), YY1 (ying-yang 1) und einem unbekannten Faktor in allen untersuchten Proben fest.
Mittels ChIP-on-Chip Analysen konnte außerdem gezeigt werden, dass die meisten der identifizierten Motive für Sp1, NRF1 und YY1 tatsächlich von dem betreffenden Faktor in normalen Zellen gebunden wurden, und dass diese Regionen in Leukämiezellen nicht von einer de novo-Methylierung betroffen waren. Desweiteren verdeutlichten die Ergebnisse, dass die stabile Bindung eines dieser Transkriptionsfaktoren an seine Konsensussequenz vom gleichzeitigen Vorkommen benachbarter Konsensusmotive abhängig ist. Folglich führen die Ergebnisse dieser Dissertation zu der Annahme, dass die kooperative Bindung von Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle für die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status von CGIs in gesunden wie auch in kranken Zellen spielt. Die Daten implizieren auch, dass die Mehrheit der de novo methylierten CGIs durch das Fehlen von Kombinationen bestimmter Sequenzmotive und der daraus resultierenden Abwesenheit aktivierender Transkriptionsfaktoren charakterisiert ist.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 08:42
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