| License: Publishing license for publications including print on demand (16MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-215664
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.21566
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 19 July 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer and Prof. Dr. Günther Bernhardt |
| Date of exam: | 15 July 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Drug metabolism, prodrugs, cilazapril, candesartan, transdermal delivery, transdermal therapeutic system, TTS, skin permeation, toxicity, reactive metabolites, reactive intermediates, trapping reaction, glutathione, LC-MS |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 21566 |
Abstract (English)
Figuratively, drug metabolism can be considered as two sides of the same coin; one leading to desired, beneficial effects, e.g. by activation of prodrugs, whereas the other one results in adverse side effects due to toxic metabolites. In this work both aspects were explored. Transdermal therapeutic systems (TTS) are known as drug formulations providing constant and sustained drug plasma levels ...
Abstract (English)
Figuratively, drug metabolism can be considered as two sides of the same coin; one leading to desired, beneficial effects, e.g. by activation of prodrugs, whereas the other one results in adverse side effects due to toxic metabolites. In this work both aspects were explored.
Transdermal therapeutic systems (TTS) are known as drug formulations providing constant and sustained drug plasma levels at reduced application frequency. Therefore, TTS are particularly advantageous for the treatment of disorders requiring long-term pharmacotherapy as, e.g., cardiovascular diseases. By now, hypertension is recognized as one of the leading risk factors for cardiovascular morbidity and mortality. However, there is a strong discrepancy between the high incidence of hypertension and the availability of transdermally applicable antihypertensive drugs.
Thus, one part of this thesis aimed at novel derivatives of the angiotensin II AT1 receptor antagonist candesartan and the angiotensin-converting enzyme inhibitor cilazapril, suitable for administration via a TTS. The prodrug approach was pursued to design and synthesize various ester-based candesartan and cilazapril prodrugs with physicochemical properties considered suitable to overcome the barrier function of the skin. The novel compounds were bioanalytically characterized with respect to solid-state stability, susceptibility for enzymatic hydrolysis, and stability against non-enzymatic hydrolysis. All candesartan and cilazapril prodrugs except for a simple ethyl ester of cilazapril were enzymatically hydrolyzed to release the active principle. Additionally, the potential candesartan prodrugs turned out to be potent angiotensin II AT1 receptor antagonists (Kb = 0.8 – 6.4 nM) in a fura-2 calcium-assay on rat glomerular mesangial cells.
The three most promising candidates of each group were selected for TTS development, namely candesartan 1-(isopropyloxycarbonyloxy)ethyl ester, candesartan 1-(2,2-dimethylpropanoyloxy)ethyl ester and candesartan morpholinoethyl ester as well as cilazapril 1-(ethoxycarbonyloxy)ethyl ester, cilazapril 1-(cyclohexyloxycarbonyloxy)ethyl ester and cilazapril morpholinoethyl ester. These new chemical entities were found to be com¬pa¬rable or even superior to the reference compounds candesartan cilexetil and cilazapril, respectively, in terms of formulate-ability, TTS quality and stability in a silicone PSA matrix.
Furthermore, the manufactured TTS containing the new prodrugs were superior to the respective candesartan cilexetil and cilazapril formulations, when investigated for trans¬dermal permeation through animal and human skin using Franz diffusion cells.
The second part of this thesis addressed the adverse side of drug metabolism, namely toxic effects due to the formation of reactive metabolites/intermediates capable of cova¬lent protein binding. In our workgroup highly potent N(G)-acylated hetarylpropylguanidine-type H2R agonists, comprising either an imidazole ring or a 2-aminothiazole group, were developed, which could serve as valuable pharmacological tools for in vitro and potential in vivo studies. There is strong evidence that cytochrome P450-mediated bioactivation of the 2-aminothiazole ring results in highly reactive intermediates.
Thus, the aim of this project was the detection and identification of reactive intermediates by co-incubating N(G)-acylated 3-(2-aminothiazol-5-yl)propylguanidines with rat liver microsomes and glutathione (GSH) to trap putative reactive molecules. By means of liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS) and appropriate MS/MS experiments such as constant neutral loss scanning, multiple reaction monitoring and product ion scanning, GSH adducts of reactive intermediates of N(G)-acylated 3-(2-aminothiazol-5-yl)propylguanidines were detected. Benefitting from the selectivity of fluorescence detection, these results were corroborated by using dansylated GSH as a trapping agent. Interestingly, blocking of the 4-position of the 2-aminothiazole by methyl substitution seemed to prevent bioactivation of the heterocycle.
Finally, unspecific toxicity of N(G)-acylated hetarylpropylguanidines was investigated, revealing considerable hemolysis and cytotoxicity in the micromolar range, particularly when the acyl part of the compounds contained highly lipophilic moieties.
In summary, the ambivalent character of drug metabolism was highlighted in this thesis. Novel synthesized prodrugs of cilazapril and candesartan turned out to be enzymatically convertible to the active drug and to be superior to the reference drugs in terms of stability, formulate-ability and skin permeability, thus representing promising compounds for transdermal antihypertensive therapy via TTS. By contrast, the identification of reactive intermediates of N(G)-acylated hetarylpropylguanidines demonstrated that one should be aware of the potential risk of bioactivation residing in structural moieties such as aminothiazoles to avoid toxification.
Translation of the abstract (German)
Der Wirkstoffmetabolismus gleicht zwei Seiten einer Medaille. Während die eine zu erwünschten Effekten führt, wie z.B. zur Aktivierung von Prodrugs, resultiert die andere in unerwünschten Nebenwirkungen aufgrund von toxischen Metaboliten. Beide Aspekte werden in dieser Arbeit betrachtet. Transdermale therapeutische Systeme (TTS) bewirken konstante, langanhaltende Blutspiegel bei geringer ...
Translation of the abstract (German)
Der Wirkstoffmetabolismus gleicht zwei Seiten einer Medaille. Während die eine zu erwünschten Effekten führt, wie z.B. zur Aktivierung von Prodrugs, resultiert die andere in unerwünschten Nebenwirkungen aufgrund von toxischen Metaboliten. Beide Aspekte werden in dieser Arbeit betrachtet.
Transdermale therapeutische Systeme (TTS) bewirken konstante, langanhaltende Blutspiegel bei geringer Applikationsfrequenz. Deshalb gelten sie als besonders vorteilhaft für die Behandlung von Krankheiten, die eine Langzeittherapie erfordern, z.B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen, für die Bluthochdruck ein Hauptrisikofaktor darstellt. Es besteht jedoch eine starke Diskrepanz zwischen der hohen Inzidenz von Bluthochdruck-Erkrankungen und transdermal applizierbaren Antihypertensiva.
Ein Ziel dieser Arbeit war deshalb die Entwicklung von neuen Derivaten des AT1-Rezeptorantagonisten Candesartan und des ACE-Hemmers Cilazapril für die Applikation via eines TTS. Das Prodrug-Konzept wurde für das Design und die Synthese von Ester-basierten Candesartan- und Cilazapril-Prodrugs mit geeigneten physikochemischen Eigenschaften zur Überwindung der Hautbarriere verfolgt. Die neuen Verbindungen wurden bioanalytisch bezüglich der Stabilität des Feststoffs, Empfindlichkeit gegenüber enzymatischer Hydrolyse und Stabilität gegen nicht-enzymatische Hydrolyse charakterisiert. Alle Candesartan- und Cilazapril-Prodrugs außer dem einfachen Ethylester von Cilazapril wurden enzymatisch zum aktiven Wirkstoff hydrolysiert. Die potentiellen Candesartan-Prodrugs erwiesen sich außerdem als potente AT1-Rezeptorantagonisten (Kb = 0,8 – 6,4 nM) in einem Fura-2-Ca2+-Assay an glomerulären Mesangial-Zellen der Ratte.
Die jeweils drei vielversprechendsten Kandidaten, nämlich Candesartan-1-(Isopropyloxycarbonyloxy)ethylester, Candesartan 1-(2,2-Dimethylpropanoyloxy)ethylester und Candesartan-Morpholinoethylester sowie Cilazapril-1-(Ethoxycarbonyloxy)ethylester, Cilazapril 1-(Cyclohexyloxycarbonyloxy)ethylester und Cilazapril-Morpholinoethylester wurden für die TTS-Entwicklung ausgewählt. Diese Verbindungen erwiesen sich im Vergleich zu den Referenz-Verbindungen Candesartan Cilexetil und Cilazapril als vergleichbar oder sogar besser in Bezug auf Formulierbarkeit, TTS-Qualität und Stabilität in einer Silikonkleber-Matrix.
Des Weiteren zeigten die neuen Prodrug-TTS in Experimenten mit Franz-Diffusionszellen eine Verbesserung der transdermalen Permeation durch Tier- und Humanhaut im Vergleich zu Candesartan Cilexetil- und Cilazapril-TTS.
Gegenstand des zweiten Teils dieser Arbeit war die „negative“ Seite des Wirkstoffmetabolismus, d.h. die Bildung von reaktiven Intermediaten, die in der Lage sind, kovalent an Proteine zu binden und zu toxischen Effekten führen können. In unserer Arbeitsgruppe wurden hoch-potente H2R-Agonisten vom Typ der N(G)-acylierten Hetarylpropylguanidine entwickelt, die entweder einen Imidazol- oder einen 2-Amino¬thiazol-Ring tragen und als wertvolle pharmakologische Werkzeuge für in vitro und potentielle in vivo Untersuchungen dienen können. Es existieren deutliche Hinweise, dass eine Cytochrom P450-vermittelte Bioaktivierung des 2-Aminothiazol-Rings zu hochreaktiven Intermediaten führt.
Das Ziel dieses Projekts war somit die Detektion und Identifikation von reaktiven Intermediaten durch Co-Inkubation von N(G)-acylierten 3-(2-Aminothiazol-5-yl)propylguanidinen mit Rattenlebermikrosomen und Glutathion (GSH) zum Abfangen von möglichen reaktiven Molekülen. Mit Hilfe von Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) und geeigneten MS/MS-Experimenten wie „constant neutral loss scanning“, „multiple reaction monitoring“ und „product ion scanning“ wurden GSH-Addukte von reaktiven Intermediaten von N(G)-acylierten 3-(2-Aminothiazol-5-yl)propylguanidinen detektiert. Diese Ergebnisse konnten durch die Verwendung von dansyliertem GSH als Abfangreagenz und der Nutzung selektiver Fluoreszenzdetektion bestätigt werden.
Bei einer Untersuchung der unspezifischen Toxizität zeigten N(G)-acylierte Hetarylpropylguanidine erhebliche Hämolyse und Zytotoxizität im mikromolaren Bereich, besonders wenn der Acylteil der Verbindungen stark lipophile Gruppierungen enthielt.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der ambivalente Charakter des Wirkstoffmetabolismus verdeutlicht. Neue Prodrugs von Cilazapril und Candesartan erwiesen sich als enzymatisch hydrolysierbar zum aktiven Wirkstoff und waren den Referenzsubstanzen in Bezug auf Stabilität, Formulierbarkeit und Hautpermeabilität überlegen, weshalb sie vielversprechende Verbindungen für die transdermale, antihypertensive Therapie via TTS darstellen. Dagegen wurde durch die Identifikation von reaktiven Intermediaten von NG-acylierten Hetarylpropylguanidinen gezeigt, dass ein potentielles Bioaktivierungsrisiko von bestimmten Strukturmotiven wie des Aminothiazol-Rings nicht außer Acht gelassen werden sollte, um toxische Effekte zu vermeiden.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 06:19
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