| License: Publishing license for publications including print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-223609
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.22360
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 17 October 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer and Prof. Dr. Günther Bernhardt |
| Date of exam: | 6 October 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | neuropeptide Y, histamine, histamine receptors, bivalent ligands, radioligand kinetics, Hill slope, equilibrium, confocal microscopy, FRET, fluorescent proteins, receptor internalization |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 22360 |
Abstract (English)
In the last three decades, a large amount of experimental data (for example Förster resonance energy transfer (FRET) at fluorescently labelled receptors) supported the hypothesis of the dimerization of G-protein-coupled receptors (GPCR), including neuropeptide Y (NPY YxR) and histamine (HxR) receptors. Targeting GPCR dimers could be helpful to understand (patho)physiological processes and may be ...
Abstract (English)
In the last three decades, a large amount of experimental data (for example Förster resonance energy transfer (FRET) at fluorescently labelled receptors) supported the hypothesis of the dimerization of G-protein-coupled receptors (GPCR), including neuropeptide Y (NPY YxR) and histamine (HxR) receptors. Targeting GPCR dimers could be helpful to understand (patho)physiological processes and may be applied therapeutically.
This work aimed at the exploration of the applicability of FRET-based and ligand-based approaches to the investigation of NPY Y1R and histamine H2R dimers. Special attention was paid to bivalent NG-acylated hetarylpropylguanidines, the most potent H2R agonists, known so far, which were initially designed to bind to the orthosteric recognition sites of dimerized H2R protomers. Surprisingly, agonists having octamethylene linkers, insufficient in length to bridge two adjacent receptor molecules, proved to be most active. Thus, the intent of this thesis was to investigate the assumed mode of binding of such “twin compounds”, e.g. with respect to the ternary complex model, allosterism and functional selectivity.
Fluorescently labelled NPY Y1 receptors: Human Y1Rs, tagged either with enhanced cyan (ECFP) or with yellow fluorescent proteins (EYFP), were stably expressed in human U-373 MG glioblastoma cells (plasmids from Prof. Dr. A. Beck-Sickinger, University of Leipzig). Membranal localization of the labelled receptors was confirmed by radioligand and flow cytometric binding assays. However, imaging of the transfected U-373 MG and CHO cells by means of confocal microscopy (CLSM) revealed primarily intracellular distribution of the fusion proteins, precluding prospective FRET-based investigations of receptor dimerization. Additionally, bivalent argininamide-type Y1R antagonists, developed in our group, did not support the hypothesis of receptor dimerization. Thus, all further work was focused on bivalent H2R/H4R ligands.
Hill slopes of bivalent H2R/H4R ligands: Radioligand binding assays were performed on Sf9 membranes, expressing either the human (h) or guinea-pig (gp) H2R-GsαS fusion protein or the hH4R, because the imidazolylpropylguanidine moiety turned out to be a privileged structure with respect to histamine receptors (cooperation with Prof. Dr. Roland Seifert, Medical School of Hannover). Saturation binding experiments confirmed that tiotidine is an inverse agonist of H2R, and that fusing of the H2Rs and GsαS proteins did not alter ligand-receptor interactions. GTPγS-dependent shifts of the competition binding curves, predicted by the ternary complex model, were found for monovalent H2R agonists, but not for the bivalent ligands, tested at the gpH2R-GsαS, suggesting antagonism rather than agonism. Additionally, Hill coefficients (nH) < 1 (negative cooperativity) observed for short bivalent compounds (gpH2R-GsαS), as well as nH > 1 (positive cooperativity) for the bivalent compound with a 20 mem¬bered linker, approximated unity after very long periods of incubation (gpH2R-GsαS and hH4R), disclosing the failure of having reached equilibrium.
Radioligand off-rate (k2): Radioligand dissociation kinetics at the gpH2R-GsαS and the hH4R (k2 of [3H]histamine at hH4R: 0.0108 ± 0.0007 min-1, reported for the first time) revealed a concentration-dependent increase in k2 in the presence of bivalent ligands. This could result from amphiphilic properties (for the “longer” bivalent compounds) or from an existence of the allosteric binding site either at the same protomer or at a neighboring receptor.
H2R internalization: Clathrin-mediated receptor endocytosis was visualized in transfected CHO cells by confocal microscopy (CLSM). Both mono- and bivalent H2R agonists, but not bivalent antagonists (with respect to G-protein activation), induced the internalization of human H2Rs fused to the monomeric far-red fluorescent protein mKate2. These observations were in line with previously obtained functional data from GTPase assays, and there is no evidence for unconventional (biased) signalling of the hH2R. By contrast, agonist-dependent activities of standard antagonists were found in GTPase assays at the hH2R-GsαS in presence of a bivalent agonist with an 8-membered linker.
In conclusion, the obtained results cannot be solely explained by the competitive binding model. Considering the size of the bivalent H2R/H4R ligands, additional temporary interactions with the extracellular domains of the receptors seem to be inevitable. Provided that the ortho- and the allosteric binding sites were occupied by two pharmacophoric moieties simultaneously, these bivalent compounds might act as true dualsteric ligands. Future work at the H2R and the H4R should be focused on the differentiation between G protein-dependent and β-arrestin-mediated signalling. Additionally, the preparation of a bivalent radioligand is suggested to determine the ligand-receptor stoichiometry.
Translation of the abstract (German)
Die Hypothese der Dimerisierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR), einschließlich Neuropeptid Y (NPY, YxR) und Histamin-Rezeptoren (HxR), wird durch experimentelle Befunde (z. B. mittels Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) gestützt. Ein Targeting solcher GPCR-Dimere könnte dazu beitragen, (patho)physiologische Prozesse besser zu verstehen und lässt sich möglicherweise therapeutisch ...
Translation of the abstract (German)
Die Hypothese der Dimerisierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR), einschließlich Neuropeptid Y (NPY, YxR) und Histamin-Rezeptoren (HxR), wird durch experimentelle Befunde (z. B. mittels Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) gestützt. Ein Targeting solcher GPCR-Dimere könnte dazu beitragen, (patho)physiologische Prozesse besser zu verstehen und lässt sich möglicherweise therapeutisch nutzen.
Ziel war es, die Anwendbarkeit von FRET- und Ligand-basierten Methoden zur Untersuchung potenzieller NPY Y1R- und Histamin-H2R-Dimere auszuloten. Im Fokus standen bivalente NG-acylierte Hetarylpropylguanidine als gegenwärtig potenteste H2R-Agonisten, welche ursprünglich für die Überbrückung der orthosterischen Bindungsstellen dimerisierter H2R-Protomere konzipiert worden waren. Überraschenderweise erwiesen sich Agonisten mit Octamethylenspacer, welche zur Verbrückung von Rezeptordimeren zu kurz erscheinen, als am potentesten. Zum Verständnis dieses Phänomens wurde versucht, den Bindungsmodus dieser bivalenten Liganden (gemäß dem Ternärkomplex-Modell, bezüglich Allosterie bzw. funktioneller Selektivität) zu ermitteln.
Fluoreszenzmarkierte NPY Y1-Rezeptoren: Humane Y1 Rezeptoren (fusioniert mit enhanced cyan bzw. gelb fluoreszierendem Protein, Plasmide von Prof. Dr. A. Beck-Sickinger, Leipzig) wurden in humanen U-373 MG Zellen stabil exprimiert. Eine membranäre Lokalisation der markierten Rezeptoren wurde auch bestätigt (Radioligand-Assay, Durchflusszytometrie). Konfokalmikroskopische Untersuchungen transfizierter U-373 MG und CHO-Zellen zeigten allerdings vorwiegend intrazelluläre Fusionsproteine, so dass FRET-Experimente hinfällig wurden. Der Einsatz bivalenter Y1R-Antagonisten vom Argininamid-Typ als pharmakologische Werkzeuge lieferte keinen Hinweis auf eventuelle Rezeptordimerisierung. Daher konzentrierten sich die Arbeiten auf die detaillierte Untersuchung bivalenter H2R/H4R-Liganden.
Hill-Koeffizienten bivalenter H2R/H4R-Liganden: Da sich Imidazolylpropylguanidin als eine priviligierte Struktur bezüglich Histamin-Rezeptoren erwies (Kooperation mit Prof. Dr. R. Seifert, Hannover), wurden Radioligand-Bindungsstudien an Sf9-Membranen durchgeführt, die entweder humanes (h) oder Meerschweinchen- (gp) H2R-GsαS Fusionsprotein bzw. hH4R exprimierten. Sättigungsexperimente bestätigten Tiotidin als inversen H2R-Agonisten. Eine Fusionierung von H2R mit GsαS veränderte die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen nicht. Eine nach dem Ternärkomplex-Modell in Gegenwart von GTPγS zu erwartende Rechtsver-schiebung der Kompetitionskurven wurde am gpH2R-GsαS bei monovalenten, jedoch nicht bei bivalenten H2R-Agonisten beobachtet, was eher für Antagonismus als für Agonismus spricht. Hill-Koeffizienten (nH) < 1 (negative Kooperativität) für „kurze“ bivalente Liganden (gpH2R-GsαS) sowie nH > 1 (positive Kooperativität) für den bivalenten Liganden mit einem 20-gliedrigen Linker näherten sich nach entsprechend langen Inkubationszeiten (gpH2R-GsαS und hH4R) dem Wert 1, was einer langsamen Gleichgewichtseinstellung entspricht.
Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (k2): Radioligand-Dissoziationskinetiken (k2 [3H]Histamin am hH4R: 0.0108 ± 0.0007 min-1) an gpH2R-GsαS und hH4R zeigten einen konzentrationsabhängigen Anstieg von k2 in Gegenwart bivalenter Liganden, wofür amphiphile Substanzeigenschaften oder die Existenz einer allosterischen Bindungsstelle am selben oder an einem benachbarten Rezeptor ursächlich sein könnten.
H2R-Internalisierung: Clathrin-vermittelte Endozytose wurde in rekombinanten CHO-Zellen mittels Konfokalmikroskopie visualisiert. Mono- und bivalente H2R-Agonisten, jedoch nicht bivalente Antagonisten, bewirkten eine Internalisierung humaner H2-Rezeptoren, die mit rot fluoreszierenden Protein (mKate2) fusioniert waren. Diese Beobachtungen passen zu früher ermittelten funktionellen Daten aus GTPase Assays, was auf keine unkonventionelle (biased) Signaltransduktion am hH2R hinweist. Im Gegensatz dazu unterschied sich die antagonistische Aktivität von Standard-Antagonisten im GTPase Assay am hH2R-GsαS, wenn statt eines konventionellen ein bivalenter H2R-Agonist (mit einem 8-gliedrigen Linker) verwendet wurde.
Mit dem kompetitiven Bindungsmodell können die erzielten Ergebnisse nicht ausreichend beschrieben werden. Unter Berücksichtigung der „Größe“ bivalenter H2R/H4R-Liganden scheinen zusätzlich zur eigentlichen Bindungsstelle Wechselwirkungen mit extrazellulären Rezeptorarealen unvermeidlich zu sein. Vorausgesetzt, dass ortho- und allosterische Bindungsstellen gleichzeitig durch zwei Pharmacophore besetzt sind, könnten die untersuchten bivalenten Verbindungen als echte „duale Liganden“ wirken. Zukünftige Arbeiten sollten sich auf eine Differenzierung zwischen G-Protein- und β-Arrestin-vermittelten Signalwegen an H2- und H4-Rezeptoren konzentrieren. Ferner könnte ein bivalenter Radioligand für die Bestimmung der Ligand-Rezeptor- Stöchiometrie hilfreich sein.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:50
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