| License: Publishing license for publications including print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-229588
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.22958
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 14 December 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer and Prof. Dr. Sigurd Elz |
| Date of exam: | 8 December 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Histaminrezeptor, Wirkstoff-Rezeptor-Bindung, H4-Rezeptor, Agonist, Antagonist, Guanidinderivate, Bioisostere, Rigidisierung, Struktur-Aktivitäts-Beziehung, Histamin, H3-Rezeptor, Cyanoguanidin, UR-PI376, OUP-16, UR-RG98, H4-receptor, H3-receptor, cyanoguanidine, chiral HPLC, fluorescent ligand, GTPyS, GPCR, bioisosteric replacement |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 22958 |
Abstract (English)
The recently discovered histamine H4 receptor (H4R) is reported to be involved in immunological processes and inflammatory diseases. However, the (patho)physiological role of the H4R is far from being fully understood. Controversial data on H4R agonists as well as reports on β-arrestin-mediated signaling and partial agonistic effects of the standard H4R antagonist JNJ-7777120 at certain H4R ...
Abstract (English)
The recently discovered histamine H4 receptor (H4R) is reported to be involved in immunological processes and inflammatory diseases. However, the (patho)physiological role of the H4R is far from being fully understood. Controversial data on H4R agonists as well as reports on β-arrestin-mediated signaling and partial agonistic effects of the standard H4R antagonist JNJ-7777120 at certain H4R species orthologs complicate the interpretation of in vivo studies. Therefore, additional potent and receptor subtype selective H4R ligands, antagonists as well as agonists, are required as pharmacological tools.
Discrimination between the closely related H3 and H4 receptors turned out to be a critical issue in the development of selective H4R agonists. Starting from UR-PI376, a lead from our laboratory, the major objective of this thesis was the design, synthesis and pharmacological characterization of bioisosteric and conformationally constrained cyanoguanidine-type H4R agonist to evaluate structure-activity and –selectivity relationships. The prepared compounds were investigated for agonism and antagonism at the human (h) H1R, H2R, H3R and H4R in functional [35S]GTPyS binding assays or steady-state GTPase assays, respectively, using Sf9 cell membranes expressing the HR subtype of interest. Selected compounds were evaluated in radioligand binding studies at the human HR subtypes (Sf9 cell membranes) and mouse H4R (mH4R expressed in HEK293 cells). In addition, representative compounds were investigated in a luciferase gene reporter assay at mH4R and hH4R using genetically engineered HEK293 cells.
In a first approach, based on a previously suggested model of UR-PI376 binding to the hH4R, the tetramethylene chain in UR-PI376 was replaced by conformationally restricted spacers connecting imidazole ring with the cyanoguanidine moiety. Phenylene linkers proved to be inappropriate: None of the prepared compounds or amine precursor showed relevant activity at the H3R and H4R. To retain some flexibility, in a second series the phenylene was replaced by a cyclohexylene linker. Compounds with a cis-configured 1,4-cyclohexylene spacer, turned out to be moderately potent and selective hH4R agonists. The same holds for the building block, cis-4-(1H-imidazol-4-yl)cyclohexylamine. In case of the trans-configured analogues, there was a tendency toward preference for the hH3R.
To optimize the spacer regarding ring size, balance between rigidification and flexibility, regioisomers and stereochemical properties a cyclopentane-1,3-diyl moiety and an additional exocyclic methylene group were introduced. The most potent H4R agonists identified among a set of 14 racemic compounds were separated by chiral HPLC to yield eight enantiomerically pure compounds. trans-(+)-(1S,3S)-UR-RG98 was the most potent and selective H4R agonist in this series with an EC50 of 11 nM, a more than 100-fold selectivity for the H4R over the H3R and negligible activities at the other HR subtypes. By contrast, the optical antipode, trans-(-)-(1R,3R)-UR-RG98, proved to be an H4R antagonist in the [35S]GTPyS assay. The absolute configuration of the stereoisomers was determined subsequent to an enzyme-assisted stereoselective synthesis.
In search for bioisosteric replacements of the imidazole ring in cyanoguanidine-type H4R agonists, ten different heterocycles were combined with linkers of various chain lengths and substitution patterns. A total of 42 compounds, cyanoguanidines and amine precursor, were synthesized and evaluated at the HR subtypes. The exchange of the 4-imidazolyl ring considerably affected the activities at all HRs. Only the 2- and 5-methyl substituted imidazoles showed H4R agonistic potency. None of the investigated compounds was superior to UR-PI376.
In an attempt to synthesize fluorescent H4R ligands several fluorophores (pyrylium, bodipy and cyanine dyes) were coupled to a benzimidazole building block, reported to have high H4R affinity. The Ki-values of the labeled compounds were only in the micromolar range (1.3 - 30 µM) at the hH4R and the other HR subtypes as well, suggesting that a different affinity-conferring moiety should be selected.
The investigation of selected H4R agonists revealed neither cytotoxicity nor hemolytic activity but remarkable plasma protein binding (up to 94 %), which has to be taken into account in future in vivo investigations.
In summary, the structural variations of the cyanoguanidine-type H4R ligands produced valuable information regarding structure-activity and structure-selectivity relationships and led to several promising pharmacological tools. The identified hH4R agonist trans-(+)-(1S, 3S)-UR-RG98 is one of the most potent and selective H4R ligands identified so far. The optimized stereochemical properties of the ligands provide valuable information with respect to future ligand design and refined ligand-receptor models.
Translation of the abstract (German)
Der kürzlich entdeckte Histamin H4-Rezeptor (H4R) scheint eine entscheidende Rolle in immunologischen und entzündungsrelevanten Prozessen zu spielen. Allerdings ist die (patho)physiologische Rolle des H4R bei weitem nicht vollständig verstanden. Widersprüchliche Daten über H4R Agonisten sowie Berichte über β-Arrestin-vermittelte Signalwege und partialagonistische Wirkung des H4R Antagonisten ...
Translation of the abstract (German)
Der kürzlich entdeckte Histamin H4-Rezeptor (H4R) scheint eine entscheidende Rolle in immunologischen und entzündungsrelevanten Prozessen zu spielen. Allerdings ist die (patho)physiologische Rolle des H4R bei weitem nicht vollständig verstanden. Widersprüchliche Daten über H4R Agonisten sowie Berichte über β-Arrestin-vermittelte Signalwege und partialagonistische Wirkung des H4R Antagonisten JNJ-7777120 an einigen H4R Speziesorthologen, erschweren die Interpretation von in vivo Studien. Daher sind zusätzliche potente und rezeptorsubtypselektive H4R Liganden, Antagonisten und Agonisten, als pharmakologische Werkzeuge erforderlich.
Diskriminierung zwischen den eng verwandten H3 und H4-Rezeptoren erwies sich als ein kritischer Punkt in der Entwicklung von selektiven H4R Agonisten. Ausgehend von UR-PI376, sollten im Rahmen dieser Arbeit H4R Agonisten mit rigidisierten und bioisosteren Teilstrukturen designed, synthetisiert und pharmakologisch charakterisiert werden. Die hergestellten Verbindungen wurden in funktionellen [35S]GTPyS-Bindungsassays oder Steady-State-GTPase-Assays an Membranen von Sf9-Zellen, die den entsprechenden HR-Subtyp exprimieren, auf Agonismus und Antagonismus an humanen (h) H1R, H2R, H3R und H4R untersucht. Ausgewählte Verbindungen wurden in Radioligandbindungsstudien an den humanen HR-Subtypen (Sf9 Zellmembranen) und am Maus H4R (mH4R in HEK293 Zellen exprimiert) untersucht. Darüber hinaus wurden repräsentative Verbindungen in einem Luciferase-Genreporter Assay (HEK293-Zellen) am mH4R und hH4R untersucht.
In einem ersten Ansatz wurde die Tetramethylenkette in UR-PI376 durch rigidisierte Linker zwischen Imidazolring und Cyanoguanidin ersetzt. Ein Phenylring erwies sich als ungeeignet: Keine der hergestellten Verbindungen oder Aminvorstufen zeigte relevante Aktivität am H3R und H4R. Um eine gewisse Flexibilität beizubehalten, wurde in einer zweiten Reihe der Phenylen- durch einen Cyclohexylenlinker ersetzt. Verbindungen mit cis-konfiguriertem 1,4-Cyclohexylenspacer entpuppten sich als mäßig potente und selektive hH4R Agonisten. Gleiches gilt für den Baustein, cis-4-(1H-imidazol-4-yl)cyclohexylamin. Im Falle der trans-konfigurierten Analoga gab es eine Tendenz zur Bevorzugung des hH3R.
Um die Ringgröße, die Balance zwischen Rigidisierung und Flexibilität, Regioisomere und stereochemische Eigenschaften zu optimieren, wurde eine Cyclopentan-1,3-diyl Einheit mit zusätzlicher exocyclischer Methylengruppe eingeführt. Die potentesten H4R Agonisten in einer Serie von 14 racemischen Verbindungen wurden durch chirale HPLC getrennt, wodurch acht enantiomerenreine Verbindungen erhalten wurden. trans-(+)-(1S,3S)-UR-RG98 war der potenteste und selektivste H4R Agonist in dieser Serie und zeigte einen EC50 von 11 nM, eine mehr als 100-fache Selektivität für den H4R im Vergleich zum H3R und vernachlässigbare Aktivitäten an den anderen HR-Subtypen. Im Gegensatz dazu erwies sich die optische Antipode, trans-(-)-(1R,3R)-UR-RG98, als H4R Antagonist im [35S]GTPyS Assay. Die absolute Konfiguration der Stereoisomere wurde mittels stereoselektiver Synthese bestimmt.
Auf der Suche nach bioisosterem Ersatz für den Imidazolring in H4R Agonisten vom Cyanoguanidintyp wurden zehn Heterocyclen mit Linker verschiedener Kettenlänge und unterschiedlichem Substitutionsmuster kombiniert. Insgesamt wurden 42 Verbindungen, Cyanoguanidine und die entsprechenden Aminvorstufen, synthetisiert und an den HR-Subtypen untersucht. Der Austausch des Imidazolrings beeinträchtigte die Aktivitäten an allen HRs erheblich. Nur die 2- und 5-methylsubstituierten Imidazole zeigten H4R agonistische Potenz, keine der untersuchten Verbindungen war UR-PI376 jedoch überlegen.
In einem Versuch zur Synthese von fluoreszierenden H4R Liganden wurden mehrere Fluorophore (Pyrylium-, Bodipy- und Cyaninfarbstoffe) an einen Benzimidazolbaustein gekoppelt, der kürzlich als hochaffiner H4R Ligand beschrieben wurde. Da die Ki-Werte der markierten Verbindungen an allen HR-Subtypen nur im mikromolaren Bereich (1,3 bis 30 µM) lagen, sollte künftig eine andere affinitätsvermittelnde Struktur gewählt werden.
Die Untersuchung ausgewählter H4R Liganden zeigte weder Zytotoxizität noch hämolytische Aktivität, jedoch bemerkenswerte Plasmaproteinbindung (bis zu 94%), die in zukünftigen in vivo Untersuchungen berücksichtigt werden sollte.
Zusammenfassend lieferten die strukturellen Veränderungen der H4R Liganden vom Cyanoguanidintyp wertvolle Informationen über Struktur-Aktivitäts- und -Selektivitäts-beziehungen und führten zu einigen vielversprechenden pharmakologischen Werkzeugen. Der hH4R Agonist trans-(+)-(1S,3S)-UR-RG98 gehört zu den potentesten und selektivsten H4R Liganden die bisher identifiziert wurden. Die optimierten stereochemischen Eigenschaften der Liganden liefern wertvolle Informationen im Hinblick auf zukünftiges Liganddesign und verbesserte Ligand-Rezeptor-Modelle.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:39
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