| License: Publishing license for publications including print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-251447
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.25144
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 3 June 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer and Prof. Dr. Günther Bernhardt |
| Date of exam: | 1 June 2012 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Neuropeptid Y, Y4 Rezeptor-Agonisten, Y4 Rezeptor-Antagonisten, Acylguanidine, Argininamid-Derivate, bivalenter Ligand, Peptide, unnatürliche Aminosäuren, Fluoreszenzligand, neuropeptide Y, Y4 receptor agonist, Y4 receptor antagonist, acylguanidines, argininamide derivatives, bivalent ligand, peptides, unnatural amino acids, labeled ligand |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 25144 |
Abstract (English)
The neuropeptide Y hormone family consists of three 36-amino acid peptides, namely neuropeptide Y (NPY), peptide YY (PYY) and pancreatic polypeptide (PP), involved in the regulation of numerous physiological processes such as food intake, blood pressure, stress, pain and hormone secretion. Among the four NPY receptor subtypes (Y1R, Y2R, Y4R, Y5R) activated by the NPY peptide family in humans, the ...
Abstract (English)
The neuropeptide Y hormone family consists of three 36-amino acid peptides, namely neuropeptide Y (NPY), peptide YY (PYY) and pancreatic polypeptide (PP), involved in the regulation of numerous physiological processes such as food intake, blood pressure, stress, pain and hormone secretion. Among the four NPY receptor subtypes (Y1R, Y2R, Y4R, Y5R) activated by the NPY peptide family in humans, the Y4R is unique due to the preferential binding of PP over NPY. The biological role of the Y4R is far from being understood, not least because of the lack of appropriate pharmacological tools. Although several PP analogs have been reported to inhibit food intake, there is a need for potent and selective smaller peptides and, in particular, for non-peptide Y4R ligands. Therefore, this work aimed at the development of both, peptidic agonists and non-peptidic antagonists, selective for the Y4R.
The first part of this thesis focused on the structural optimization of UR-AK 49 (Ki = 68 µM, IC50 = 60.9 µM), a NG-acylated imidazolylpropylguandine, originally designed as H2R agonist and identified as the first weak Y4R antagonist. Replacement of the imidazolyl ring by moieties known as “privileged structures” of GPCR ligands, led to the identification of a NG-acylated phenylpiperazinylguanidine with 12-fold higher Y4R activity compared to UR-AK 49. However, variation of the NG-substituent by introducing highly lipophilic residues (e.g. diphenyl, cyclohexyl), which turned out to be superior to polar or basic substituents, did not further improve Y4R antagonistic potency. Unfortunately, the increase in lipophilicity and amphiphilic character of the acylguanidines was accompanied with hemolysis and cytotoxicity. The latter turned out to be incompatible with whole cell based assays, so that this project was discontinued.
Serendipitously, on the occasion of selectivity studies moderate Y4R antagonists were identified among a set of bivalent BIBP 3326 analogs, which were originally designed as Y1R antagonists. Systematic investigation of monovalent and bivalent argininamide-type derivatives led to the discovery of the first non-peptidic antagonist for the NPY Y4R, a bivalent ligand with submicromolar affinity (Ki = 132 nM). As the Y1R prefers (R)-configured compounds such as BIBP 3226, the selectivity ratio Y4R/Y1R was considerably improved by incorporation of the (S)-configured argininamide building block. Hence, this class of compounds is considered a promising starting point in the search of more potent and selective Y4R antagonist. Furthermore, the bivalent ligand approach may be useful to obtain pharmacological tools for studying receptor dimerization.
The major part of this work focused on truncated pNPY and hPP analogs comprising unnatural and D-amino acids as selective Y4R agonists. Within a cooperation with Prof. Dr. Oliver Reiser (University of Regensburg) cis-pentacin (cpen) containing pNPY(25-36) was identified as a Y4R ligand with a Ki value in the low nanomolar range (Ki = 10 nM) and an excellent selectivity profile. On this basis additional peptide derived ligands were synthesized and characterized. To reduce the peptidic nature of these compounds, truncated ligands, containing unnatural amino acids, were prepared. The C-terminal pentapeptides [cpen34] or [Leu34]pNPY(32-36) showed Y4R affinity in the low nanomolar range, in particular when Thr32 was exchanged by Tyr. In general, the developed pNPY analogs were superior to the hPP analogs with respect to Y4R selectivity. Interestingly, the incorporation of D-Pro into [cpen34]hPP(25-36) led to potent Y4R ligands with a highly improved selectivity profile.
Aiming at pharmacological tools for the study of NPY receptors, fluorescence-labeling of subtype selective peptides was performed. [cpen34]pNPY(25-36) as well as the Y2R selective pNPY(18-36) were conjugated to green- and red fluorescent dyes (5(6)-SFX, Alexa Fluor 488, Cy5). With the introduction of an NG-functionalized arginine building block, developed in our workgroup and optimized in terms of stability and synthetic accessibility, convenient fluorescence labeling became possible, leading to Y2R and Y4R selective pharmacological tools with high affinity. Compared to the green fluorescent compounds, the red fluorescent peptides were superior due to higher signal-to-noise ratios. Regardless of that, especially the Alexa Fluor 488 labeled compounds proved to be suitable for confocal microscopy and flow cytometry.
In conclusion, the peptides/peptidomimetics and fluorescent pharmacological tools described in this thesis provide a promising basis for the optimization of Y4R ligands. Combining this knowledge with the experience made with the argininamide-type bivalent ligands may pave the way to the design of non-peptidic antagonists of the Y4R.
Translation of the abstract (German)
Neuropeptid Y (NPY), Peptid YY (PYY) und pankreatisches Polypeptid (PP) bestehen jeweils aus 36 Aminosäuren und gehören zur Neuropeptid Y Familie, welche an der Regulation verschiedener physiologischer Prozesse wie z.B. Nahrungsaufnahme, Blutdruck-Regulation, Stress, Schmerz und Hormonausschüttung beteiligt ist. Unter den vier humanen NPY-Rezeptorsubtypen (Y1, Y2, Y4, Y5) nimmt der Y4R eine ...
Translation of the abstract (German)
Neuropeptid Y (NPY), Peptid YY (PYY) und pankreatisches Polypeptid (PP) bestehen jeweils aus 36 Aminosäuren und gehören zur Neuropeptid Y Familie, welche an der Regulation verschiedener physiologischer Prozesse wie z.B. Nahrungsaufnahme, Blutdruck-Regulation, Stress, Schmerz und Hormonausschüttung beteiligt ist. Unter den vier humanen NPY-Rezeptorsubtypen (Y1, Y2, Y4, Y5) nimmt der Y4R eine Sonderstellung ein, da er PP im Vergleich zu NPY bevorzugt bindet. Die Beteiligung des Y4R an der Regulation physiologischer Prozesse ist jedoch bei Weitem noch nicht vollständig geklärt, nicht zuletzt auf Grund fehlender, geeigneter „pharmakologischer Werkzeuge“ wie potenter und selektiver kurzer Peptide und insbesondere nicht-peptidischer Liganden. Ziel der vorliegenden Arbeit war sowohl die Entwicklung selektiver peptidischer Agonisten als auch nicht-peptidischer Antagonisten für den NPY Y4R.
Ein Teilprojekt beschäftigte sich mit der Strukturoptimierung von UR-AK 49, einem NG-acylierten Imidazolylpropylguanidin, welches ursprünglich als Histamin H2R Agonist entwickelt und als erster schwacher Y4R Antagonist (Ki = 68 µM, IC50 = 60.9 µM) identifiziert werden konnte. Der Austausch des Imidazol-Rings durch „privilegierte Strukturen“, die von Liganden anderer G-Protein-gekoppelter Rezeptoren bekannt sind, führte schließlich zu einem NG-acylierten Phenylpiperazinylguanidin mit einer 12-fach höheren Y4R Aktivität als UR-AK 49. Modifikationen des NG-Substituenten durch den Einsatz lipophiler Strukturen (z.B. Diphenyl, Cyclohexyl) führten zu keiner weiteren Verbesserung der antagonistischen Aktivität am Y4R. Vielmehr war die Erhöhung des amphiphilen Charakters der Liganden mit einer hämolytischen und zytotoxischen Wirkung verbunden, was Probleme bei der Durchführung zell-basierter Assays zur Folge hatte. Dieses Projekt wurde deshalb nicht weiter verfolgt.
Bei der Charakterisierung bivalenter BIBP 3226 Analoga, welche ursprünglich als Y1R Antagonisten konzipiert worden waren, fielen überraschenderweise einige Liganden wegen antagonistischer Aktivität am Y4R auf. Systematische Untersuchungen zahlreicher monovalenter und bivalenter Argininamid-Derivate führten zur Identifizierung des ersten nicht-peptidischen NPY Y4R Antagonisten mit submikromolarer Affinität (Ki = 132 nM). Da der Y1R bevorzugt (R)-konfigurierte Argininamide wie BIBP 3226 bindet, konnte das Selektivitätsverhältnis Y1R zu Y4R durch die Einführung eines (S)-konfigurierten Bausteins stark verbessert werden. Daher sind die Argininamide als aussichtsreiche Strukturklasse für die Suche nach potenten und selektiven Y4R Antagonisten einzustufen. Von Argininamiden abgeleitete bivalente Liganden könnten zudem nützliche „pharmakologische Werkzeuge“ zur Untersuchung der Rezeptor-Dimerisierung darstellen.
Der Hauptteil dieses Promotionsprojekts beschäftigte sich mit der Untersuchung und Entwicklung verkürzter sowie durch unnatürliche Aminosäuren modifizierter Analoga von pNPY und hPP mit dem Ziel, selektive Y4R Agonisten zu erhalten. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. O. Reiser (Universität Regensburg) wurde durch Einführung von cis-Pentacin (cpen) in pNPY(25-36) ein Y4R-Agonist mit einem Ki-Wert von 10 nM und ausgezeichnetem Selektivitätsprofil erhalten. Dieser diente als Prototyp für die Synthese und Charakterisierung weiterer Peptid-Liganden. Zur Verringerung des peptidischen Charakters wurden verkürzte Analoga und Peptidomimetika mit weiteren unnatürlichen Aminosäuren entworfen. Die entsprechenden C-terminalen Pentapeptide mit [cpen34] oder [Leu34] besaßen Ki-Werte im niedrigen nanomolaren Bereich, insbesondere nach einem zusätzlichen Austausch von Thr32 gegen Tyr. Im Allgemeinen waren die pNPY- den hPP-Analoga hinsichtlich der Y4R-Subtypselektivität überlegen. Durch Einführung von D-Pro in [cpen34]hPP(25-36) wurde jedoch ebenfalls eine Verbesserung des Selektivitätsprofils bei nahezu gleicher Affinität erreicht.
Mit dem Ziel, Fluoreszenzliganden zur Untersuchung von NPY-Rezeptoren zu erhalten, wurden [cpen34]pNPY(25-36) sowie der Y2R selektive Ligand pNPY(18-36) mit grün sowie rot fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Zur Verknüpfung mit den Fluorophoren wurde ein NG-funktionalisierter Arginin-Baustein in die Peptide integriert. Die rot fluoreszierenden Liganden waren den grün fluoreszierenden Verbindungen aufgrund ihres höheren Signal-Rausch-Verhältnisses überlegen. Allerdings erwies sich auch ein mit Alexa Fluor 488 markierter Ligand für die Konfokalmikroskopie sowie für durchflusszytometrische Bindungsstudien als geeignet.
Die hergestellten Peptide/Peptidomimetika und die fluoreszenzmarkierten Substanzen stellen eine vielversprechende Basis für die Optimierung von Y4R Liganden dar. In Verbindung mit den Erkenntnissen, die im Rahmen der Untersuchung bivalenter Argininamide gewonnen wurden, scheint die Entwicklung nicht-peptidischer Y4R Antagonisten möglich.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 04:34
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