In eukaryotic genomes, chromatin is the template of all nuclear processes including transcription, recombination and replication. Besides the wrapping of DNA in nucleosome core particles, eukaryotic chromatin is associated, interpreted and modified by numerous protein complexes including transcription factors, DNA and RNA metabolizing machineries, architectural proteins and chromatin remodeling ...
Zusammenfassung (Englisch)
In eukaryotic genomes, chromatin is the template of all nuclear processes including transcription, recombination and replication. Besides the wrapping of DNA in nucleosome core particles, eukaryotic chromatin is associated, interpreted and modified by numerous protein complexes including transcription factors, DNA and RNA metabolizing machineries, architectural proteins and chromatin remodeling and modifying enzymes. To understand how specific genomic loci adopt different functional states, it is critical to characterize the corresponding compositional changes in the local chromatin structure. In this work, a previously established technique based on site specific recombination at defined genomic locations was used to purify selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae under native conditions. After improvement of yield and purity of the chromatin preparation, the proteomes co-purifying with domains derived from the multi-copy ribosomal DNA locus transcribed by RNA polymerases I, II and III and at an autonomous replication sequence could be defined by comparative mass spectrometry (MS). Many protein components known to interact with the respective chromatin domains were identified as well as several new factors, for which association with rDNA chromatin could be confirmed in vivo. Mass spectrometric analysis allowed further to assess the posttranslational modifications of histones associated with the individual domains. In addition, electron microscopic analysis provided single molecule information about nucleosome configurations at 5S ribosomal RNA genes. First statistical analyses indicate a heterogeneous population of chromatin states likely correlating with different stages of transcriptional activity. Finally, the improved protocol was applied to the PHO5 gene in order to explore the potential of purifying genes that are only present in one copy per cell. The results indicate that PHO5 associated histone molecules can be enriched in sufficient amounts for MS analysis, opening the door to fully define the specific posttranslational histone modification state at virtually every gene in yeast.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In eukaryotischen Genomen stellt Chromatin die Matrize aller nukleären Prozesse wie Transkription, Rekombination und Replikation dar. Neben dem Aufwickeln der DNA in nukleosomale Kernpartikel, ist eukaryotisches Chromatin assoziiert und wird interpretiert und modifiziert durch zahlreiche Proteinkomplexe, darunter Transkriptionsfaktoren, DNA- und RNA-metabolisierende Maschinerien, strukturelle ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In eukaryotischen Genomen stellt Chromatin die Matrize aller nukleären Prozesse wie Transkription, Rekombination und Replikation dar. Neben dem Aufwickeln der DNA in nukleosomale Kernpartikel, ist eukaryotisches Chromatin assoziiert und wird interpretiert und modifiziert durch zahlreiche Proteinkomplexe, darunter Transkriptionsfaktoren, DNA- und RNA-metabolisierende Maschinerien, strukturelle Proteine und Chromatin-remodulierende und modifizierende Enzyme. Um zu verstehen wie spezifische genomische Loci verschiedene funktionelle Zustände einnehmen, ist es entscheidend, die entsprechenden kompositionellen Änderungen in der lokalen Chromatinstruktur zu charakterisieren. In dieser Arbeit wurde eine bereits etablierte Technik, basierend auf ortspezifischer Rekombination an spezifischen genomischen Loci, verwendet um bestimmte chromosomale Domänen aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae unter nativen Bedingungen zu reinigen. Nach Verbesserung von Ausbeute und Reinheit der Chromatin-Präparationen konnten die assoziierten Proteome mit spezifischen Teilbereichen des Multikopien-ribosomalen DNA Lokus, welche von RNA Polymerase I, II und III transkribiert werden, sowie mit einer autonomen Replikationssequenz durch vergleichende Massenspektrometrie (MS) bestimmt werden. Neben vielen bekannten Proteinkomponenten der entsprechenden Chromatindomänen konnten auch mehrere neue Faktoren identifiziert werden, deren Assoziation mit rDNA Chromatin in vivo bestätigt werden konnte. Massenspektrometrische Analysen erlaubten weiter die Bestimmung der posttranslationalen Modifikationen von Histonen, die mit den verschiedenen Domänen assoziiert waren. Zusätzlich erlaubten elektronenmikroskopische Analysen Einzelmolekül-Informationen über die Nukleosomenkonfigurationen an 5S ribosomalen RNA Genen zu gewinnen. Erste statistische Analysen deuten auf eine heterogene Verteilung hin, die wahrscheinlich mit verschiedenen transkriptionellen Zuständen korrelieren. Schließlich wurde das verbesserte Protokoll auf das PHO5-Gen angewendet, um potentiell Chromatindomänen zu reinigen, die nur einmal pro Zelle existieren. Die Ergebnisse deuten an, dass PHO5-assoziierte Histonmoleküle in ausreichenden Mengen für MS-Analysen angereichert werden können. Dies eröffnet die Möglichkeit, den vollständigen posttranslationalen Histonmodifikationszustand jedes Gens in der Hefe zu definieren.
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