| License: Publishing license for publications excluding print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-280481
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.28048
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 4 April 2013 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | histamine H4 receptor, histamine H3 receptor, luciferase, reporter gene assay, radioligand binding assay, cAMP responsive element, receptor species orthologs, HEK293T cells |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 28048 |
Abstract (English)
G-protein coupled receptors (GPCRs) represent the most important class of drug targets for the currently available pharmacotherapeutics. In the histamine receptor (HR) field, antagonists of H1 and H2 receptors are well established drugs for many decades, whereas the more recently identified H3 (H3R) and H4 receptors (H4R) are considered promising biological targets for drug discovery programs. ...
Abstract (English)
G-protein coupled receptors (GPCRs) represent the most important class of drug targets for the currently available pharmacotherapeutics. In the histamine receptor (HR) field, antagonists of H1 and H2 receptors are well established drugs for many decades, whereas the more recently identified H3 (H3R) and H4 receptors (H4R) are considered promising biological targets for drug discovery programs. Translational animal models are indispensable for investigations on the (patho)physiological role of novel receptors as well as for preclinical studies of potential drug candidates. Thus, with respect to the predictivity of such studies, pharmacological differences between H3R and H4R species orthologs should be identified as early as possible, both in binding and functional assays, in particular on human (h) compared to rodent (m, r) HR subtypes. This thesis aimed at the development of cellular binding and functional assays for the hH4R, mH4R, rH4R, hH3R and rH3R.
In a whole-cell radioligand binding assay, saturation binding experiments on HEK293T cells, stably expressing the hH4R, the H3,4R ligand [3H]UR-PI294 was bound with high affinity. Competition binding experiments revealed affinities of reference ligands in a highly reproducible manner. Affinities of agonists were lower than reported data from binding assays using broken cell preparations, probably due to high GTP concentrations in intact cells. Regarding the mH4R, saturation binding experiments on HEK293T cells stably transfected with the mH4R gene revealed substantially lower affinities of [3H]UR-PI294 and [3H]histamine compared to the hH4R. Therefore, it turned out to be exceedingly difficult to obtain valid and robust mH4R binding data for reference ligands.
To establish functional assays for the hH4R and mH4R, using a more distal and non-radioactive readout, compared to [32P]GTPase or [35S]GTPγS assays, the aforementioned transfectants were stably co-transfected with a vector encoding the firefly luciferase (Luc), the transcription of which is under the control of the cAMP responsive element (CRE). Assay parameters were optimized, and a luciferase reporter gene assay was established in the 96-well format of a luminescence plate reader. Moreover, HEK293T cells lacking the H4R were stably transfected with the CRE-linked luciferase gene (HEK293-CRE-Luc) and established to uncover off-target effects in control experiments. To develop a reporter gene assay for the rH4R, HEK293-CRE-Luc cells were stably co-transfected with the rH4R gene. For validation, functional data of agonists, antagonists and inverse agonists were determined. In case of agonism at the hH4R, the data correlated well with data gained from [32P]GTPase or [35S]GTPγS assays. This also held for the rank order of agonists at the mH4R and rH4R, however, the potencies were up to 100-fold higher in the luciferase assay. Obviously, there was a positive effect on the distal readout by activation/amplification of or cross-talk between different signaling pathways in the established reporter gene assay.
Saturation binding experiments on whole HEK293T cells, stably expressing the hH3R, revealed high-affinity binding of [3H]N(alpha)methylhistamine ([3H]NAMH). This is consistent with recognition of the active receptor population, which was predominantly present due to high constitutive activity of the hH3R expressed in HEK293T cells. Whereas affinities of agonists and antagonists determined in competition binding experiments were in agreement with published data, inverse agonists achieved lower affinities. In studies at the rH3R stably expressed in HEK293-CRE-Luc cells, [3H]UR-PI294 was able to label a distinctly higher number of rH3Rs than [3H]NAMH, presumably, due to binding to the receptor protein in both, the active and inactive state. Consequently, in competition binding experiments with [3H]UR-PI294, cytosolic GTP shifted the binding data of agonists toward lower affinities, whereas affinities of antagonists and inverse agonists were consistent with reported data from broken cell systems.
For the functional characterization of H3R ligands at the human and rat H3 receptors, a luciferase assay was established. HEK293-CRE-Luc cells were stably co-transfected with a vector encoding for the hH3R. In case of the rH3R the aforementioned rH3R expressing transfectant was used. In contrast to the rH3R, the hH3R displayed exceptionally high constitutive activity. This became obvious by increased basal activity of the hH3R and was confirmed by means of inverse agonists.
The established reporter gene (luciferase) assays allowed for the quantification of agonistic, inverse agonistic and antagonistic activity in a highly sensitive and reliable manner. In summary, the developed cell-based methods will improve the predictability of in vivo results by characterizing compounds on H3R and H4R species orthologs regarding affinity, subtype selectivity, quality of action and potency.
Translation of the abstract (German)
G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die wichtigste Klasse von Zielproteinen für die derzeit verfügbaren Pharmakotherapeutika dar. Auf dem Gebiet der Histaminrezeptoren (HR) sind Antagonisten des H1 und H2 Rezeptors seit Jahrzehnten bewährte Arzneimittel, während die erst kürzlich identifizierten H3 (H3R) und H4 Rezeptoren (H4R) als vielversprechende neue biologische Zielmoleküle ...
Translation of the abstract (German)
G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die wichtigste Klasse von Zielproteinen für die derzeit verfügbaren Pharmakotherapeutika dar. Auf dem Gebiet der Histaminrezeptoren (HR) sind Antagonisten des H1 und H2 Rezeptors seit Jahrzehnten bewährte Arzneimittel, während die erst kürzlich identifizierten H3 (H3R) und H4 Rezeptoren (H4R) als vielversprechende neue biologische Zielmoleküle gelten. Translationale Tiermodelle sind zur Untersuchung der (patho)physiologischen Funktion von Rezeptorproteinen sowie für präklinische Studien mit potentiellen Arzneimittelkandidaten unverzichtbar. Pharmakologische Unterschiede zwischen H3R und H4R Spezies-Orthologen, insbesondere zwischen den HR Subtypen des Menschen (h) und Nagetieren (m, r), sollten daher so früh wie möglich sowohl in Bindungs- als auch in Aktivitätsassays identifiziert werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von zellulären Bindungs- und Aktivitätsassays für die Histaminrezeptoren hH4R, mH4R, rH4R, hH3R und rH3R.
In einem Radioligandbindungsassay mit intakten Zellen wurde der H3/4R Ligand [3H]UR-PI294 von gentechnisch veränderten HEK293T Zellen, die den hH4R stabil exprimieren, in Sättigungsexperimenten mit hoher Affinität gebunden. In Kompetitionsbindungsexperimenten konnten Affinitäten von Referenzliganden sehr gut reproduzierbar bestimmt werden. Affinitäten von Agonisten waren, möglicherweise aufgrund der hohen GTP Konzentration in intakten Zellen, niedriger als Literaturdaten, die aus Bindungsassays mit aufgeschlossenen Zellen gewonnen wurden. Für den mH4R wurden in Sättigungsbindungsexperimenten mit HEK293T Zellen, die stabil mit dem mH4R Gen transfiziert werden konnten, im Vergleich zum hH4R wesentlich niedrigere Affinitäten für [3H]UR-PI294 und [3H]Histamin ermittelt. Daher war es äußerst schwierig, zuverlässige und robuste mH4R Bindungsdaten für Referenzliganden zu erhalten.
Für funktionelle Untersuchungen an hH4R und mH4R wurde ein Assay etabliert, der ein späteres Ereignis des Signaltransduktionsweges als im Fall des [32P]GTPase oder [35S]GTPγS Assays nutzt. Dazu wurden die oben erwähnten Zellen stabil mit einem Genkonstrukt co-transfiziert, das für die Glühwürmchen-Luciferase (Luc) kodiert, deren Expression unter der Kontrolle eines cAMP-responsive-Elementes (CRE) steht. Nach Optimierung der Versuchsparameter wurde ein Luciferase-Reportergenassay im 96-well Format entwickelt. Weiterhin wurden HEK293T Zellen ohne H4R stabil mit dem CRE-gesteuerten Luciferasegen transfiziert (HEK293-CRE-Luc) und zur Aufdeckung von off-target-Effekten in Kontrollexperimenten erfolgreich eingesetzt. Um einen Reportergenassay für den rH4R zu entwickeln, wurden HEK293-CRE-Luc Zellen stabil mit dem rH4R Gen co-transfiziert. Zur Validierung konnten funktionelle Daten von Agonisten, Antagonisten und inversen Agonisten mit einem Lumineszenz-Plattenleser bestimmt werden. Im Falle von Agonismus am hH4R korrelierten die Daten gut mit Literaturwerten aus dem [32P]GTPase oder [35S]GTPγS Assay. Das galt auch für die Rangfolge der Agonisten am mH4R und rH4R, allerdings waren die Wirkstärken im Luciferaseassay bis zu 100-fach höher. Wahrscheinlich führt eine Aktivierung oder die gegenseitige Beeinflussung verschiedener Signalwege zu einer Amplifizierung des späten Signals im etablierten Reportergenassay.
Sättigungsbindungsexperimente mit intakten HEK293T Zellen, die den hH3R stabil exprimieren, ergaben eine hochaffine Bindung von [3H]N(alpha)-Methylhistamin ([3H]NAMH). Dies steht in Übereinstimmung mit der Bindung an die aktive Konformation des Rezeptors, welche aufgrund hoher konstitutiver Aktivität des hH3R in HEK293T Zellen vorherrscht. Während die in Kompetitionsbindungsexperimenten bestimmten Affinitäten von Agonisten und Antagonisten mit publizierten Daten übereinstimmen, liegen die ermittelten Werte für inverse Agonisten niedriger als erwartet. In Studien am rH3R, stabil exprimiert in HEK293-CRE-Luc Zellen, markierte [3H]UR-PI294, ein Radioligand, der als Partialagonist wahrscheinlich sowohl an die aktive als auch an die inaktive Form des Rezeptorproteins bindet, eine deutlich höhere Anzahl von rH3Rs als [3H]NAMH. Dies ist vereinbar mit der Vorstellung, dass zytosolisches GTP die Affinitäten von Agonisten zu niedrigeren Werten verschiebt, während die Daten von Antagonisten und inversen Agonisten mit Literaturwerten, die an Zellhomogenaten gewonnen wurden, übereinstimmen.
Zur funktionellen Charakterisierung von Liganden am H3R des Menschen und der Ratte wurde ein Luciferaseassay etabliert. HEK293-CRE-Luc Zellen konnten stabil mit dem hH3R Gen co-transfiziert werden. Im Falle des rH3R wurden die zuvor erwähnten rH3R exprimierenden Zellen benutzt. Im Gegensatz zum rH3R zeigte der hH3R eine außergewöhnlich hohe konstitutive Aktivität. Dies wurde durch eine erhöhte basale Rezeptoraktivität deutlich und konnte mittels inverser Agonisten bestätigt werden.
Die etablierten Reportergenassays (Luciferase) sind sehr sensitiv und ermöglichen die zuverlässige Quantifizierung von agonistischen, invers agonistischen und antagonistischen Aktivitäten. Die entwickelten Zell-basierten Methoden verbessern die Vorhersagbarkeit von In-vivo-Ergebnissen durch die Charakterisierung von Verbindungen an H3R und H4R Spezies-Orthologen in Hinblick auf Affinität, Subtypselektivität, Wirkqualität und Wirkstärke.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 02:51
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