| License: Publishing license for publications excluding print on demand (16MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-287298
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.28729
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 August 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Stefan Dove and Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 2 August 2013 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Histamine H2 receptor, GPCR activation, molecular dynamics simulation, GROMACS, site directed mutagenesis, Sf9 cells, Tyr5.38, extracellular loop 3 |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 28729 |
Abstract (English)
G-protein coupled receptors (GPCR) are the most important drug target family in humans. In the last decades, our knowledge about GPCR structure, conformational states, activation and their role in signal transduction has substantially increased. A huge number of novel agonists, antagonists and inverse agonists, including bivalent and functionally selective ligands, has been developed. More ...
Abstract (English)
G-protein coupled receptors (GPCR) are the most important drug target family in humans. In the last decades, our knowledge about GPCR structure, conformational states, activation and their role in signal transduction has substantially increased. A huge number of novel agonists, antagonists and inverse agonists, including bivalent and functionally selective ligands, has been developed. More recently, crystal structures of about 20 GPCRs have been resolved. Structures of inactive and active receptor states are available now which allow invaluable insights into GPCR activation. The histamine H2 receptor (H2R) belongs to the majority of GPCRs with unknown 3D structure. However, its relatedness to the β-adrenoceptors (βAR) with resolved structures of both states makes the H2R an interesting target for structural analysis.
The aim of this thesis was to investigate differences between inactive and active human (h) H2R states with in-silico methods like homology modeling and molecular dynamics (MD) simulations. To improve and extend tools provided by the MD package GROMACS for analyzing structures and interactions, novel routines were written. Furthermore, in-vitro site-directed mutagenesis studies should answer open questions on the role of specific amino acids in the H2R. Tyr182(5.38) residing in the orthosteric binding site of the hH2R was replaced by Phe. In a second approach, guinea pig (gp) H2R mutants were generated replacing acidic amino acids in the third extracellular loop (ECL3) in order to investigate the possibility that they belong to a second binding site for bivalent hetarylpropylguanidine-type agonists with higher potency than their monovalent analogs. Moreover, the question was whether the high number of acidic amino acids in ECL3 of the gpH2R compared to other aminergic GPCRs is of importance at all.
Homology models of inactive and active hH2R states were constructed using the structures of the β1AR (inactive) and β2AR (active) as templates. With the intention to compare different models of active hH2R states with respect to reliability and to select the ‘best’ model, another active hH2R state variant was generated, using the templates tβ1AR and opsin. Both active state models were complexed with a C-terminal Gsα-protein fragment. The resulting models were embedded in a natural environment consisting of a 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine bilayer and water molecules as solvent. The models were subjected to 80 ns MD simulations performed with GROMACS. The analysis of the results was improved by novel routines for the systematic calculation of direct and water mediated H-bonds and of van der Waals contacts. Additionally, a structure validation tool for proteins in MD simulation systems was written, probing the stereochemistry at Cα atoms and the planarity of aromatic side chains, delocalized π-electron systems and peptide bonds. Furthermore, backbone Φ/Ψ dihedral angles (Ramachandran analysis) as well as side chain torsion were measured and compared to experimental reference values.
The quality of the homology models before and during the MD simulations in terms of backbone and side chain conformations was in very good agreement to experimental protein data. Crucial rearrangements between the inactive and the active hH2R state especially in the cytoplasmic domain were similar to changes observed at crystal structures. All molecular switches suggested to be essential for receptor activation were connected to the pronounced outward move of TM6 upon receptor activation: the parallel rearrangement of TM5 and TM6, the cleavage of the ionic lock, the disruption of a hydrophobic barrier in the center of the TM bundle, the inward move of TM7 including the highly conserved NPxxY(x)5,6F motif, the rearrangement of the H-bond network around TM7, and alterations at the bottom of the binding site. As key amino acids for the hH2R activation Arg116(3.50), Tyr202(5.58), Glu229(6.30), Phe243(6.44), Asn280(7.45) and Tyr288(7.53) were identified.
Site-directed mutagenesis experiments were based on the expression of mutant cDNA in Sf9 cells using bacculoviruses. Membranes containing the recombinant proteins were prepared. The H2R mutants were characterized by testing H2R agonists and antagonists in the GTPase and GTPγS assay.
Pharmacological investigations with the Tyr182Phe mutant of the hH2R revealed that, unlike previously expected, the hydroxyl group of Tyr182(5.38) has only a minor effect on ligand binding. Most ligands tested exhibited a similar potency (pEC50) and intrinsic activity as at the wild-type hH2R. The suggested second binding site in ECL3 for bivalent agonists was not confirmed by results on three gpH2R mutants in which acidic amino acids were replaced by serines. However, acidic residues in ECL3 are possibly responsible for the integrity of the orthosteric binding site and/or for the pathway of some ligands into the binding pocket. The exceptionally high number of negatively charged amino acids in ECL3 of the gpH2R seems not to be generally necessary for proper receptor function.
Translation of the abstract (German)
G-protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) gehören zu den wichtigsten Zielproteinen für Arzneistoffe. In den letzten Jahrzehnten nahm unser Wissen über Struktur, Konformationszustände und Aktivierung von GPCR sowie über ihre Rolle in der Signaltransduktion bedeutend zu. Eine Vielzahl von Agonisten, Antagonisten und inversen Agonisten, einschließlich bivalenter und funktionell selektiver Liganden ...
Translation of the abstract (German)
G-protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) gehören zu den wichtigsten Zielproteinen für Arzneistoffe. In den letzten Jahrzehnten nahm unser Wissen über Struktur, Konformationszustände und Aktivierung von GPCR sowie über ihre Rolle in der Signaltransduktion bedeutend zu. Eine Vielzahl von Agonisten, Antagonisten und inversen Agonisten, einschließlich bivalenter und funktionell selektiver Liganden wurde entwickelt. Darüber hinaus existieren Röntgenkristallstrukturen von ca. 20 GPCR, darunter neuerdings auch von aktiven Rezeptorkonformationen, die wichtige Erkenntnisse über die GPCR-Aktivierung erlauben. Der Histamin H2 Rezeptor (H2R) gehört zu den GPCR, für die noch keine 3D Struktur vorliegt. Die Verwandtschaft zu den β-Adrenozeptoren (βAR), für die inaktive und aktive Zustände kristallisiert wurden, macht den H2R jedoch zu einem interessanten Objekt für strukturelle Analysen.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung inaktiver und aktiver humaner (h) H2R-Zustände mit in-silico Methoden wie Homologiemodellierung und Molekulardynamiksimulationen (MD). Zur Verbesserung und Erweiterung von Subfunktionen der MD-Software GROMACS wurden neue Programme zur Struktur- und Interaktionsanalyse erstellt. Des Weiteren sollte die Funktion bestimmter Aminosäuren mit Hilfe gezielter H2R-Mutanten aufgeklärt werden. Tyr182(5.38) in der orthosterischen Bindetasche des hH2R wurde durch Phe ersetzt. In einem zweiten Projekt wurden Meerschweinchen- (gp) H2R-Mutanten erzeugt, bei denen saure Aminosäuren in der dritten extrazellulären Schleife (ECL3) ersetzt wurden. Vermutet wurde, dass diese eine zweite Bindungsstelle für Agonisten vom Typ der bivalenten Hetarylpropylguanidine bilden (erhöhte Potenz im Vergleich zu monovalenten Analogen). Zudem sollten Gründe für den hohen Anteil saurer Aminosäuren in der ECL3 des gpH2R gefunden werden.
Modelle von inaktiven und aktiven hH2R-Konformationen wurden unter Verwendung der Strukturen des β1AR (inaktiv) bzw. des β2AR (aktiv) erstellt. Um verschiede Modelle des hH2R im aktiven Zustand miteinander zu vergleichen und das „beste“ Modell auszuwählen, wurde ein weiteres hH2R-Modell aus dem β1AR und Opsin erzeugt. An beiden aktiven hH2R-Modellen wurde ein C-terminales Gsα-Proteinfragment gedockt. Die Modelle wurden in eine natürliche Membranumgebung, bestehend aus Dipalmitoylphosphatidylcholinen und Wassermolekülen als Lösungsmittel, eingebracht und nach Äquilibrierung einer 80 ns dauernden MD-Simulation mit GROMACS unterworfen. Die Analyse der Ergebnisse wurde verbessert durch neue Programme zur systematischen Berechnung von direkten und wasservermittelten H-Brücken sowie von van-der-Waals-Kontakten. Zusätzlich wurde ein Strukturvalidierungsprogramm für Proteine in MD-Simulationen erstellt, das die Stereochemie an Cα-Atomen und die Planarität von aromatischen Seitenketten, delokalisierten π-Elektronensystemen und Peptidbindungen prüft. Außerdem wurden Diederwinkel des Proteinrückgrats (Ramachandrananalyse) sowie der Seitenketten gemessen und mit experimentellen Werten verglichen.
Die Qualität der Homologiemodelle bezüglich der Diederwinkel von Aminosäuren vor und während der MD-Simulationen war im Einklang mit experimentellen Daten. Unterschiede zwischen dem inaktiven und aktiven hH2R, besonders im cytoplasmatischen Bereich, waren ähnlich zu entsprechenden Änderungen in Kristallstrukturen. Alle molekularen Kopplungen die für die Rezeptoraktivierung bedeutend sind, waren verbunden mit einer Auswärtsbewegung der TM6: die parallele Anordnung von TM5 und TM6, das Aufbrechen des „ionic lock“ und der hydrophoben Barriere im Zentrum des TM-Bündels, die Bewegung der TM7 mit dem NPxxY(x)5,6F-Motiv nach innen, die Modifikationen des H-Brückennetzwerks nahe TM7 sowie die Veränderungen am Boden der Bindetasche. Als entscheidend für die H2R-Aktivierung konnten Arg116(3.50), Tyr202(5.58), Glu229(6.30), Phe243(6.44), Asn280(7.45) und Tyr288(7.53) identifiziert werden.
H2R-Mutanten wurden mit Hilfe entsprechend veränderter cDNA generiert, die in Sf9 Zellen mit Hilfe von Bacculoviren exprimiert wurde. Mit den rekombinanten Proteinen wurden Membranpräparationen erstellt und die H2R-Mutanten mit H2R-Agonisten und Antagonisten im GTPase- und GTPγS-Assay charakterisiert.
Die pharmakologische Untersuchung der Tyr182Phe-Mutante ergab, dass – anders als unsprünglich vermutet – die Hydroxylgruppe von Tyr182(5.38) nur einen geringen Einfluss auf die Ligandbindung hat. Die meisten getesteten Liganden zeigten eine ähnliche Potenz (pEC50) und intrinsische Aktivität wie am Wildtyp-Rezeptor. Die vermutet zweite Bindungsstelle für bivalente Agonisten in der ECL3 wurde durch die Ergebnisse an drei gpH2R-Mutanten, in denen saure Aminosäuren durch Serin ersetzt wurden, nicht bestätigt. Möglicherweise sind saure Aminosäuren in der ECL3 jedoch verantwortlich für die Intaktheit der orthosterischen Bindetasche und/oder für den Pfad einiger Liganden dorthin. Der besonders hohe Anteil saurer Aminosäuren in der ECL3 des gpH2R scheint nicht generell für eine korrekte Rezeptorfunktion notwendig zu sein.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 01:56
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