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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-305058
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 1 August 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer and Prof. Dr. Sigurd Elz |
| Date of exam: | 18 July 2014 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | histamine H4R ligands, GPCR, radioligands |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 30505 |
Abstract (English)
G-protein coupled receptors (GPCRs) are the most important class of biological targets of approved pharmacotherapeutics and hold great potential for the development of future drugs as well. Histamine and neuropeptide Y (NPY) receptors are representative examples of aminergic and peptidergic GPCRs, respectively. Even though the histamine H4 receptor (H4R) has been suggested as a potential ...
Abstract (English)
G-protein coupled receptors (GPCRs) are the most important class of biological targets of approved pharmacotherapeutics and hold great potential for the development of future drugs as well. Histamine and neuropeptide Y (NPY) receptors are representative examples of aminergic and peptidergic GPCRs, respectively.
Even though the histamine H4 receptor (H4R) has been suggested as a potential therapeutic target for the modulation of various inflammatory and immunological disorders, its (patho)physiological role is far from being fully understood. Therefore, additional potent and receptor subtype selective H4R ligands are required as molecular tools.
In search for agonists for the human (h) and murine (m) H4R, a series of 2-arylbenzimidazoles was synthesized, inspired by the structure of a recently published H4R agonist (N-[2-(1H-imidazol-4-yl)ethyl]-3-[4-(5-fluoro-4-methyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-3-methyl¬phenoxy]¬propan-1-amine). The compounds were pharmacologically characterized in vitro in radioligand and [35S]GTPgammaS binding assays using membrane preparations of Sf9 insect cells or HEK293 cells stably expressing the hH4R or the mH4R. Extension of the carbon chain between the imidazole and the amino group by two methylene groups was tolerated, revealing higher affinities and potencies (Ki = 0.58 nM, EC50 = 1.2 nM). In addition to the introduction of a 5-methyl substituent at the imidazole ring, rigidization to a spinaceamine derivative was most effective regarding H4R selectivity. Structural changes aiming at replacing the imidazole moiety, e. g. by guanidines, amides and aromatic residues, resulted in a decrease in affinity at the hH4R. Although affinities and activities at the mH4R were lower compared to the data for the hH4R, surprisingly, the 5-methylimbutamine derivative revealed an EC50 value of 7.0 nM at the mH4R (alpha = 0.8).
Aiming at H4R agonists with increased selectivity for the H4R over the other HxR subtypes, the combination of VUF 8430 (S-(2-guanidinylethyl)isothiourea, a molecule devoid of an imidazole; Ki (hH4R) = 17.7 nM) with the putatively bioisosteric acylguanidine moiety of the NG-acylated imidazolylalkylguanidines was applied. This approach resulted in compounds with reduced hH4R affinities compared to the reference substance. Highest hH4R affinity (Ki ~100 nM) were found for small alkanoyl residues (propanoyl/isobutyryl) at the guanidine group.
Due to a shortage of high affinity radioligands for the investigation of the histamine H2 receptor, the squaramide [3H]UR-DE257 was synthesized and pharmacologically characterized. The Kd‐value (20 nM) determined by kinetic experiments was in agreement with the dissociation equilibrium constant (31 nM) from saturation analysis. [3H]UR-DE257 proved to be a useful tool to determine the H2R binding affinities of unlabeled ligands in competition binding experiments.
The tritium-labeled version of the widely used potent H4R antagonist JNJ7777120 ((5-chloro-1H-indol-2-yl)(4-methylpiperazine-1-yl)methanone) was synthesized and pharmacologically characterized. The investigation of [3H]JNJ7777120 revealed that this compound is far from being an ideal standard ligand or, not to mention, an optimal pharmacological tool. Due to high non-specific binding, the purported benefit of [3H]JNJ7777120, a selective radiolabeled H4R antagonist, compared to the non-selective HxR agonist [3H]histamine was not confirmed. Nevertheless, the results of competition binding experiments were in accordance to reported data. The exceptionally high affinity of JNJ7777120 for the murine H4R, reported in literature, was not reproduced.
The guanidine-acylguanidine bioisosteric approach was applied to the preparation of the tritiated argininamide-type Y2R-selective radioligand [3H]UR-PLN208. Pharmacological investigation revealed differences between peptidic agonists and nonpeptide antagonists regarding displacement of the radioligand, compatible with the concept of insurmountable antagonism and pseudo-irreversible binding.. Time-dependent depression of the NPY-induced Ca2+-response was demonstrated in the fura-2 assay on hY2R expressing CHO cells The data suggest different or partially overlapping binding sites of BIIE 0246-like antagonists and NPY, supporting the idea of ligand-specific receptor conformations.
Taken together, several of the synthesized 2-arylbenzimidazoles harbor the potential of molecular tools and will hopefully contribute to a better understanding of the structure-activity- and structure-selectivity relationships of H4R ligands on human and murine receptor orthologs. The synthesized and pharmacologically characterized tritium-labeled radioligands [3H]UR-DE257, [3H]JNJ7777120 and [3H]UR-PLN208 for GPCRs are proven pharmacological tools for the detection of the respective receptor in vitro and for investigations on the antagonistic binding mode, respectively, as well as for the identification and characterization of new ligands at the respective target.
Translation of the abstract (German)
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die wichtigste Klasse biologischer Zielstrukturen für zugelassene Pharmaka und besitzen ein großes Potenzial für die Entwicklung neuer Arzneistoffe. Histamin- und Neuropeptid Y (NPY)-Rezeptoren sind repräsentative Beispiele aminerger und peptiderger GPCRs. Auch wenn der Histamin H4-Rezeptor (H4R) als ein potenzieller therapeutischer Angriffspunkt für ...
Translation of the abstract (German)
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die wichtigste Klasse biologischer Zielstrukturen für zugelassene Pharmaka und besitzen ein großes Potenzial für die Entwicklung neuer Arzneistoffe. Histamin- und Neuropeptid Y (NPY)-Rezeptoren sind repräsentative Beispiele aminerger und peptiderger GPCRs.
Auch wenn der Histamin H4-Rezeptor (H4R) als ein potenzieller therapeutischer Angriffspunkt für die Behandlung verschiedener entzündlicher und immunologischer Erkrankungen vorgeschlagen wurde, ist seine (patho)physiologische Rolle nicht vollständig aufgeklärt. Deshalb sind weitere potente und selektive H4R Liganden als molekulare Werkzeuge erforderlich.
Auf der Suche nach Agonisten für den humanen (h) und murinen (m) H4R wurde, ausgehend von der Struktur eines kürzlich veröffentlichten H4R-Agonisten (N-[2-(1H-Imidazol-4-yl)ethyl]-3-[4-(5-fluor-4-methyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-3-methylphenoxy]propan-1-amin), eine Serie von 2-Arylbenzimidazolen synthetisiert. Diese Verbindungen wurden pharmakologisch in vitro in Radioligandbindungsexperimenten und funktionellen [35S]GTPgammaS-Bindungsassays an Membranen von Sf9-Insektenzellenn oder intakten HEK293-Zellen, die den hH4R oder den mH4R exprimieren, charakterisiert. Eine Verlängerung der Alkylkette zwischen dem Imidazolring und der Aminogruppe um zwei Methylgruppen wurde toleriert und führte zu einer höheren Affinität und Potenz (Ki = 0,58 nM, EC50 = 1,2 nM). Hinsichtlich H4R-Selektivität war, neben der Einführung eines 5-Methyl-Substituenten am Imidazol, die Rigidisierung zu einem Spinaceamin-Derivat am effektivsten. Versuche, den Imidazolring durch Guanidine, Amide und Aromaten zu ersetzen, führte zu einer Abnahme der Affinität am hH4R. Obwohl die Affinitäten und Aktivitäten am mH4R niedriger waren im Vergleich zum hH4R, erhielt man für das 5-Methylimbutamin-Derivat überraschenderweise ein EC50-Wert von 7,0 nM am mH4R (alpha = 0,8).
Durch die Kombination der Partialstrukturen des „Imidazol-freien“ H4R-Agonisten VUF 8430 ((S)-(2-Guanidinylethyl)isothioharnstoff, Ki (hH4R) = 17,7 nM) mit einem Acylguanidin-Rest, dem mutmaßlichen Guanidin-Bioisoster der NG-acylierten Imidazolylalkylguanidine, wurde versucht, die Selektivität für den H4R gegenüber den anderen HxR-Subtypen zu erhöhen. Dieser Ansatz führte zu Verbindungen mit verringerter hH4R-Affinität im Vergleich zu den Referenzsubstanzen. Acylguanidine mit kleinen Alkylresten (Propyl/Isobutyl) zeigten hierbei die höchste hH4R-Affinität (Ki ~100 nM).
Mangels geeigneter hochaffiner Radioliganden für den H2R wurde das Quadratsäureamid [3H]UR-DE257 synthetisiert und pharmakologisch charakterisiert. Der kinetische Kd-Wert (20 nM) stimmte gut mit der Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation (31 nM) aus Sättigungsexperimenten überein. Darüber hinaus erwies sich [3H]UR-DE257 als ein nützliches Werkzeug, um die H2R Bindungsaffinitäten nicht markierter Liganden zu bestimmen.
Die tritiierte Form des breit angewendeten potenten H4R-Antagonisten JNJ7777120 ((5-Chlor-1H-indol-2-yl)(4-methylpiperazin-1-yl)methanon) wurde synthetisiert und pharmakologisch charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass diese Verbindung die Anforderungen an einen idealen Standardliganden bei weitem nicht erfüllt. Aufgrund einer hohen unspezifischen Bindung konnte der erwartete Vorteil von [3H]JNJ7777120 als markierter H4R-selektiver Antagonist, verglichen mit dem Agonisten [3H]Histamin, nicht bestätigt werden. Dennoch stimmten Ki-Werte aus Verdrängungsexperimenten mit [3H]JNJ7777120 gut mit Referenzdaten überein. Ein Literaturbericht über eine außergewöhnlich hohe Affinität von JNJ7777120 für den mH4R konnte nicht bestätigt werden.
Der bioisostere Ersatz eines Guanidins durch ein Acylguanidin führte zum Y2R selektiven Radioliganden [3H]UR-PLN208. Pharmakologische Untersuchungen zeigten eine pseudo-irreversible Bindung des Radioliganden und ein unterschiedliches Verdrängungsverhalten peptidischer Agonisten und nichtpeptidischer Antagonisten. Die zeitabhängige Depression der NPY-induzierten Ca2+-Antwort im Fura-2-Assay an hY2R-CHO-Zellen weist darauf hin, dass die Bindungsstellen von BIIE 0246-Analoga und NPY unterschiedlich sind oder nur teilweise überlappen, und unterstützt die Vorstellung, dass es möglich ist, ligandabhängig unterschiedliche Rezeptorkonformationen zu stabilisieren.
Zusammengefasst zeigen einige der synthetisierten 2-Arylbenzimidazole das Potenzial, als molekulare Werkzeuge zu dienen und zu einem besseren Verständnis der Struktur-Aktivitäts-und Struktur-Selektivität-Beziehungen von H4R Liganden an humanen und murinen H4Rs beizutragen. Die synthetisierten und pharmakologisch charakterisierten Tritium-markierten Radioliganden [3H]UR-DE257, [3H]JNJ7777120 und [3H]UR-PLN208 sind geeignete pharmakologische Werkzeuge zum Nachweis des jeweiligen Rezeptors in vitro, zur Untersuchung des Bindungsverhaltens von Agonisten und Antagonisten sowie zur Identifizierung und Charakterisierung entsprechender GPCR-Liganden.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:33
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