| License: Publishing license for publications including print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-321747
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.32174
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 18 March 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Michael Rehli |
| Date of exam: | 18 March 2015 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III |
| Keywords: | DNA methylation, DNA demethylation, Epigenetics, Hematopoiesis, PU.1 |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 32174 |
Abstract (English)
DNA demethylation processes have been studied for many years and entered the focus of extensive research with the discovery of active demethylation mechanisms (He et al., 2011; Ito et al., 2011; Iyer et al., 2009; Kriaucionis and Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009). These processes contribute to the regulation of cell type-specific gene expression patterns and the dynamics of other epigenetic ...
Abstract (English)
DNA demethylation processes have been studied for many years and entered the focus of extensive research with the discovery of active demethylation mechanisms (He et al., 2011; Ito et al., 2011; Iyer et al., 2009; Kriaucionis and Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009). These processes contribute to the regulation of cell type-specific gene expression patterns and the dynamics of other epigenetic mechanisms (Wu and Zhang, 2014). The investigation of the different types of mechanisms and their role in different cell types or developmental stages is an important challenge to understand the complex regulatory processes in mammals. The data presented in this work allowed further insights into the active demethylation processes and contributed to the understanding of regulatory mechanisms in different hematopoietic cell types. Using an in vitro model system, representing the human mononuclear phagocyte system, we were able to characterize the active DNA demethylation mechanism in the absence of passive demethylation events. The data revealed that the targeted, locus-specific active DNA demethylation process is initiated by the modification of 5mC to 5hmC. Further experiments based on the knockdown of candidate enzymes identified TET2 as the initiator of the active DNA demethylation process and as being responsible for the conversion of 5mC to 5hmC. Investigation of further possible players like TDG, MBD4, OGT, and HELLS gave first insights into a possible contribution to the process and so far the data indicated that none of the enzymes is involved in the first conversion step. Functional investigation of the demethylated regions in reporter gene assays linked the local binding of TFs like PU.1 and synchronous demethylation events to the activation of potential enhancer elements. The data demonstrated that their activation depended on the methylation level and that demethylation led to enhancer activation in a cell type-specific manner. Moreover the results indicated that the activation of cell type-specific enhancer elements requires a corresponding set of TF to open the regions, which may include the removal of 5mC in this process.
The validation and adaption of a 5hmC-enrichment method to next generation sequencing allowed us to investigate the active demethylation processes on a genome-wide level. Using the Hydroxymethyl CollectorTM kit we assessed the global dynamics of DNA demethylation and its association with the key hematopoietic transcription factor PU.1 in differentiating monocytes. The global screen illustrated dynamic patterns of 5hmC and confirmed its role as an intermediate of active demethylation events accompanying the transition into another cell type. Local binding of PU.1 at demethylated sites further supported the theory of a correlation between demethylation events and the recruitment of PU.1. However, active DNA demethylation events were not altogether dependent on PU.1 binding, since several regions accumulated 5hmC in the absence of this TF, indicating the involvement of other factors and thus a site-specific recruitment of PU.1. The data further hinted at a possible regulatory role of 5hmC as an epigenetic mark, actively recruiting or passively impeding other factors. Further gene ontology analyses confirmed the immunological background of the cells and presented genes involved in the immune response and inflammation to be associated with active demethylation processes and the local appearance of PU.1. Corresponding expression changes suggested an involvement of PU.1 in the regulation of transcriptional changes during monocyte differentiation. However, regions with increasing or stable 5hmC levels displayed transcriptional changes independent of demethylation or PU.1 and supported the involvement of other factors in their regulation as well as possible regulatory functions of 5hmC.
A global screen of PU.1 distribution in differentiating monocytes illustrated dynamic PU.1 binding patterns upon the transition into another cell type and confirmed the association with demethylation events at subsets of PU.1 target regions. Comparing the 5hmC and PU.1 dynamics during monocyte differentiation we presented first evidence for a distinct chronology of PU.1 and demethylation events. In a subset of PU.1 target regions demethylation was present in monocytes but recruited PU.1 primarily on the transition into a new cell type. It is still unclear, if PU.1 generally profits from the opening of demethylated regions or if it administrates various functions at different target regions. The localization of the PU.1 patterns to active, cell type-specific regulatory elements revealed distinct distribution dynamics during cell differentiation. PU.1 is mainly targeted to promoter and promoter-distal regulatory regions that are activated in a cell type-specific manner. The active nature of the regions supported an involvement of PU.1 in hematopoietic cell differentiation. PU.1 binding was associated with marginally dynamic, demethylated states and indicated a role for PU.1 in the maintenance of an active transcriptional state or its independent recruitment to demethylated regulatory regions.
In summary the data presented in this work contributed to the understanding of the active DNA demethylation mechanism and revealed dynamic global association of demethylation events and PU.1 binding accompanying cell fate decisions in hematopoietic cells.
Translation of the abstract (German)
Im Rahmen der Entdeckung aktiver DNA-Demethylierungsprozesse rückten DNA-Demethylierungsmechanismen erstmals in den Fokus der aktuellen Forschung (He et al., 2011; Ito et al., 2011; Iyer et al., 2009; Kriaucionis and Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009). Diese Mechanismen sind innerhalb der Zelle nicht nur an der Regulation der Genexpression, sondern auch an anderen epigenetischen Prozessen ...
Translation of the abstract (German)
Im Rahmen der Entdeckung aktiver DNA-Demethylierungsprozesse rückten DNA-Demethylierungsmechanismen erstmals in den Fokus der aktuellen Forschung (He et al., 2011; Ito et al., 2011; Iyer et al., 2009; Kriaucionis and Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009). Diese Mechanismen sind innerhalb der Zelle nicht nur an der Regulation der Genexpression, sondern auch an anderen epigenetischen Prozessen beteiligt (Wu and Zhang, 2014). Zur Aufklärung dieser komplexen regulatorischen Prozesse in Säugern liefern Untersuchungen epigenetischer Mechanismen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und Zelltypen einen wichtigen Beitrag. So auch die im Folgenden präsentierten Daten. Sie tragen zum allgemeinen Verständnis von aktiven DNA-Demethylierungsmechanismen bei und liefern neue Erkenntnisse im Bezug auf die Zellregulation während der Hämatopoese.
Für die Untersuchungen wurde ein in-vitro-Modell für das humane mononukleäre Phagozytensystem verwendet, welches eine Charakterisierung des aktiven DNA-Demethylierungsmechanismus unter Ausschluss passiver Demethylierungsprozesse ermöglicht. Es konnte gezeigt werden, dass aktive DNA-Demethylierung in hämatopoetischen Zellen lokusspezifisch ist und durch die Umwandlung von 5mC in 5hmC initiiert wird. In weiteren Knockdown-Experimenten wurde TET2 als Katalysator der Umwandlungsreaktion von 5mC in 5hmC und somit als Initiator der aktiven DNA-Demethylierung identifiziert. Die Untersuchung weiterer Kandidatenenzyme wie TDG, MBD4, OGT und HELLS lieferte weitere Erkenntnisse im Bezug auf den DNA-Demethylierungsmechanismus. Es konnte gezeigt werden, dass keines dieser Enzyme im ersten Schritt, der Umwandlung von 5mC in 5hmC, involviert ist. Funktionelle Untersuchungen der demethylierten Regionen in Reporterassays stellten eine Verbindung zwischen der lokalen Interaktion von Transkriptionsfaktoren, wie z.B. PU.1, der zeitgleichen DNA-Demethylierung und der Aktivierung potentieller Enhancerelemente her. Die Daten zeigten, dass die Aktivierung dieser Elemente von ihrem Methylierungszustand abhängig ist und dass die Demethylierung zur Aktivierung eines zelltypspezifischen Enhancerrepertoires führt. Ein korrespondierendes Set an Transkriptionsfaktoren scheint hierbei essentiell für die Zugänglichkeit der Regionen zu sein und das Entfernen von 5mC könnte eine entscheidende Rolle in diesem Prozess spielen.
Zur Analyse der DNA-Demethylierungsprozesse auf globaler Ebene wurde eine 5hmC-Anreicherungsmethode zunächst adaptiert und anschließend validiert. Mit Hilfe des Hydroxymethyl CollectorTM Kits konnten die globalen Muster der DNA-Demethylierung und mögliche Assoziationen mit dem hämatopoetischen Transkriptionsfaktor PU.1 in differenzierenden Monozyten untersucht werden. Die genomweiten Daten zeigten dynamische Muster von 5hmC und bestätigten seine Rolle als Zwischenprodukt von aktiven DNA-Demethylierungsprozessen während der Differenzierung hämatopoetischer Zellen. Außerdem bekräftigten die lokalen Bindungsmuster von PU.1 in demethylierten Regionen die Theorie eines Zusammenhangs zwischen der Rekrutierung von PU.1 und DNA-Demethylierungsprozessen. Es zeigte sich allerdings, dass nicht alle DNA-Demethylierungsereignisse mit PU.1 assoziiert sind. Einige Regionen reicherten 5hmC auch in Abwesenheit von PU.1 an, was einerseits auf die Beteiligung anderer Faktoren und andererseits auf eine spezifische Rekrutierung von PU.1 hindeutet. Des Weiteren lieferten die Daten Hinweise auf eine mögliche Rolle für 5hmC als epigenetischer Marker, welcher andere Faktoren aktiv rekrutieren oder passiv deren Bindung blockieren kann. Gene-Ontology-Analysen bestätigten nicht nur den immunologischen Hintergrund des Zellsystems, sondern stellten auch einen Zusammenhang zwischen Demethylierungsprozessen, PU.1 und wichtigen Genen der Entzündungsreaktion bzw. der Immunantwort her. Ergebnisse aus entsprechenden Genexpressionsanalysen ließen außerdem eine regulatorische Funktion von PU.1 auf Transkriptionsebene während der Monozytendifferenzierung vermuten. Dies war jedoch nicht in allen untersuchten Regionen der Fall. In einer Reihe von Regionen mit ansteigenden bzw. stabilen 5hmC Levels gab es Hinweise auf eine von der Demethylierung und PU.1-Bindung unabhängige Regulation der Transkription. Hierbei könnten andere Faktoren oder auch 5hmC selbst als Signalmolekül eine Rolle spielen.
In genomweiten Analysen wurden außerdem die Bindungsprofile von PU.1 in differenzierenden Monozyten untersucht. Dynamische Veränderungen der PU.1-Bindung während der Zelldifferenzierung bekräftigten eine mögliche Assoziation des hämatopoetischen Regulators mit aktiven Demethylierungsprozessen in einer Reihe von PU.1-Zielregionen. Im direkten Vergleich mit 5hmC-Profilen konnten erste Hinweise auf eine chronologische Reihenfolge von PU.1-Bindung und aktiver DNA-Demethylierung gezeigt werden. In einem Teil der PU.1-Zielregionen fand bereits im Monozytenstadium eine Demethylierung statt während PU.1 erst im Laufe der Differenzierung dort angereichert wurde. Aktuell ist noch immer unklar, ob PU.1 generell von der „Öffnung“ demethylierter Regionen profitiert oder ob der Faktor auch regulatorische Funktionen an einem Teil der Regionen ausübt. Untersuchungen von regulatorischen DNA Elementen in differenzierenden Monozyten zeigten auch hier zelltypspezifische Bindeprofile für PU.1. Vor allem Promotoren und promotordistale Einheiten reicherten zelltypspezifisch PU.1 an. Deren Aktivität ließ außerdem einen funktionellen Hintergrund der PU.1-Rekrutierung während der Differenzierung vermuten. PU.1 war in den meisten Fällen mit bereits demethylierten, regulatorischen Regionen assoziiert. Der Faktor könnte dort z.B. aktiv zur Aufrechterhaltung des aktiven Transkriptionslevels rekrutiert werden oder auch freiliegende Bindestellen unabhängig besetzen.
Zusammenfassend tragen die in dieser Arbeit präsentierten Daten maßgeblich zum allgemeinen Verständnis von aktiven DNA Demethylierungsprozessen bei. Auf lokaler und globaler Ebene konnten Zusammenhänge zwischen dynamischen Demethylierungsprofilen und PU.1-Bindung vor allem im Zuge der Entwicklungsentscheidungen in hämatopoetischen Zellen gezeigt werden.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:35
Owner only: item control page
Download Statistics