| License: Publishing license for publications excluding print on demand (28MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-331093
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.33109
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 2 February 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Date of exam: | 17 December 2015 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie > Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Keywords: | miRNA, kidney, podocyte |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 33109 |
Abstract (German)
Mit Hilfe verbesserter Sequenzierungstechniken konnte in den letzten zehn Jahren die Expression tausender kleiner, hoch konservierter RNAs, der miRNAs, in einer Vielzahl von Geweben und Organen in ganz unterschiedlichen Organismen identifiziert werden. Inzwischen ist bekannt, dass sie in Säugetieren eine wichtige Rolle in der post-transkriptionellen Regulation vieler zellulärer Prozesse, ...
Abstract (German)
Mit Hilfe verbesserter Sequenzierungstechniken konnte in den letzten zehn Jahren die Expression tausender kleiner, hoch konservierter RNAs, der miRNAs, in einer Vielzahl von Geweben und Organen in ganz unterschiedlichen Organismen identifiziert werden. Inzwischen ist bekannt, dass sie in Säugetieren eine wichtige Rolle in der post-transkriptionellen Regulation vieler zellulärer Prozesse, beispielsweise in verschiedenen Signalwegen, spielen.
Podozyten sind hochspezialisierte Zellen, die eine komplexe, dreidimensionale Zytoarchitektur besitzen. Sie befinden sich in den Nierenkörperchen, wo sie die Kapillaren mit ihren ineinandergreifenden Fußfortsätzen bedecken. Zwischen diesen bilden sie eine komplexe Proteinstruktur, das Schlitzdiaphragma, aus, das für die Filtration des Blutes zum Primärharn verantwortlich ist. Durch mehrere Studien an Mäusen, die unter einem podozyten-spezifischen Knockout der miRNA prozessierenden Enzyme Drosha und Dicer leiden (Harvey et al. 2008, Ho et al. 2008, Shi et al. 2008, Zhdanova et al. 2011), wurde gezeigt, dass miRNAs nicht nur für die Entwicklung, sondern auch für die Erhaltung der Podozytenstruktur und -funktion essentiell sind. Da die komplexe Zytoarchitektur der Podozytenfußfortsätze in diesen Knockout-Mäusen verloren geht, stellen die Proteine, die für den Aufbau und die Stabilisierung der Schlitzdiaphragmen zwischen den Fußfortsätzen verantwortlich sind, potentielle Ziele für die miRNA vermittelte Regulation dar.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten aus Glomeruli und Tubuli, die aus C57/bl6-wildtyp Mäusen isoliert wurden, miRNA-Expressionsprofile mittels deep sequencing generiert und durch Northern Blotting und qPCR-Analyse validiert werden. Zur Identifizierung von miRNAs, die in Podozyten angereichert sind, wurden diese frisch aus einer doppelt-fluoreszierenden Cre-Reporter-Maus isoliert (Möller et al. 2003, Muzumdar et al. 2007). Die generierten miRNA-deep sequencing-Profile der murinen Podozyten und der glomerulären Endothel- und den Mesangialzellen wurden analysiert. Auf diese Weise wurden miRNAs identifiziert, die in Podozyten gegenüber den Endothel- und Mesangialzellen angereichert sind. Die Anreicherung spezifischer miRNAs in den glomerulären Zellpopulationen, einschließlich der podozytären miRNA-Kandidaten, wurde stichprobenartig per qPCR-Analyse validiert. Durch die Analyse der 3‘-UTRs humaner und muriner Transkripte, die für Proteine kodieren, welche für die Podozytenstruktur und –funktion wichtig sind, und anschließende in silico-Vorhersagen wurden mögliche regulatorische miRNA-mRNA Paare vorhergesagt. Eine Gruppe von möglichen Zielgenen wurde genauer untersucht. Von diesen Proteinen ist eine direkte Interaktion mit dem wichtigsten Protein des Schlitzdiaphragmas, Nephrin, bekannt. Zur Untersuchung dieser möglichen Zielgene wurden Luciferase Assays durchgeführt. Dazu wurden HEK293T Zellen mit einem Plasmid, das eine Luciferase mit der jeweiligen 3‘-UTR kodiert und einem Plasmid, das entsprechend eine spezifische reife miRNA oder eine Kontrollsequenz überexprimiert, transfiziert.
Darüber hinaus wurde zur Identifikation von miRNA Zielgenen in vivo eine Ago-IP (Argonaute Immunprezipitation) aus immortalisierten humanen und murinen Podozyten durchgeführt und mit einer anschließenden qPCR-Analyse der Transkripte kombiniert. Die Anreicherung der Zielgene in den Ago-gebundenen Proben konnte bestätigt werden.
Zwei Methoden zur Manipulation der miRNA-Spiegel, „miRNA-sponges“ für den Knockdown von miRNA-Familien und der genomische Knockout von miRNAs mit Hilfe von TALE Nukleasen, wurden erfolgreich in verschiedenen immortalisierten Zelllinien angewendet. Die Funktionalität von „miR-sponges“ gegen mehrere miRNA-Familien, die in Podozyten stark exprimiert sind, konnte mit Hilfe von Luciferase Assays in humanen immortalisierten Podozyten nachgewiesen werden. Mit Hilfe von TALE-Nukleasen konnten mir-30a Knockout-Zelllinien aus HEK293T Zellen hergestellt werden. Sowohl die verminderte Expression der reifen miR-30a-5p als auch die vermehrte Expression eines bekannten miR-30a-5p Zielgens in Podozyten, Notch1 (Wu et al. 2014), konnte in diesen Klonen gezeigt werden.
Der Transkriptionsfaktor LMX1B spielt für die Erhaltung der Podozytenstruktur und –funktion eine wichtige Rolle. Um seinen möglichen Einfluss auf die miRNA-Spiegel in vivo zu analysieren, wurden Glomeruli und Podozyten von Lmx1b Knockout-Mäusen isoliert und mit Kontrollmäusen verglichen. In Lmx1b Knockout-Podozyten wurden 48 reife hochregulierte und 40 herunterregulierte miRNAs gefunden. Dies weist auf eine Rolle dieses Transkriptionsfaktors in der Expressionskontrolle von miRNAs in Podozyten hin. In Lmx1b Knockout-Glomeruli wurde eine Reduktion der miR-200 Familie festgestellt. Diese miRNA-Familie wurde später als in den nicht-podozytären, glomerulären Zellen exprimiert identifiziert, was auf einen sekundären Effekt des Lmx1b Knockouts hinweist. Die miRNAs mit veränderten Expressionsspiegeln nach dem Lmx1b Knockout sind mögliche Ausgangspunkte für die Aufklärung der Entstehung des Nagel-Patella-Syndroms, einer humanen genetischen Erkrankung, die durch Mutationen im LMX1B Gen verursacht wird, sein.
Die vorliegende Arbeit trägt zur Aufklärung über das miRNA-gesteuerte regulative Netzwerk in Podozyten, das die Erhaltung der komplexen Zytoarchitektur und die Funktion in der renalen Filtration unterstützt, bei.
Translation of the abstract (English)
In the last decade, thousands of small, highly conserved regulative RNAs, e.g. the miRNAs, could be identified to be expressed in various tissues and organs of many different species using the improved sequencing techniques. Meanwhile it is known that they play important roles in the post-transcriptional regulation of various cellular processes, e.g. different signaling pathways, in mammalian ...
Translation of the abstract (English)
In the last decade, thousands of small, highly conserved regulative RNAs, e.g. the miRNAs, could be identified to be expressed in various tissues and organs of many different species using the improved sequencing techniques. Meanwhile it is known that they play important roles in the post-transcriptional regulation of various cellular processes, e.g. different signaling pathways, in mammalian organisms.
Podocytes are unique, specialized cells with a very elaborate three-dimensional cytoarchitecture. Being located in the glomeruli of the kidney, they cover the glomerular capillaries with their interdigitating foot processes. In-between these processes, they build up slit diaphragms, complex protein structures responsible for the filtration of the blood, forming the primary urine. From different studies working with mice harboring a podocyte specific knockout for miRNA processing enzymes Dicer and Drosha (Harvey et al. 2008, Ho et al. 2008, Shi et al. 2008, Zhdanova et al. 2011), it is known that miRNAs are not only important for the development, but also responsible for maintenance of podocyte structure and function. Since this complex cytoarchitecture of the podocyte foot processes is lost in the described knockout mice, the proteins building up and stabilizing the slit diaphragms in-between the foot processes represent putative targets of miRNA dependent regulation.
In the present work, deep sequencing miRNA profiles were generated using glomeruli and tubules isolated from C57bl/6 wildtype mice and validated by Northern Blotting as well as qPCR analysis. However, to identify miRNAs enriched in podocytes, cells where freshly isolated from a double fluorescent Cre reporter mouse (Möller et al. 2003, Muzumdar et al. 2007). Analyzing deep sequencing profiles of miRNAs expressed in murine podocytes and the other glomerular cells, endothelial and mesangial cells, a subset of mature miRNAs was identified to be enriched in podocytes compared to the other glomerular cell types. The enrichment of a subset of miRNAs in the glomerular cell populations, including podocyte candidate miRNAs, was validated by qPCR. By analyses of the human and murine 3’-UTR of transcripts coding for proteins important for podocyte structure and function and subsequent in silico predictions, putative regulatory miRNA-mRNA pairs in podocytes were predicted. A subset of putative structural target genes were analyzed in more detail. All of them are known to interact directly with the main protein building up the slit diaphragm, nephrin. To investigate these putative targets, luciferase assays were performed. HEK293T cells were transfected using a plasmid coding for a targeted luciferase together with a plasmid overexpressing a mature miRNA or a control sequence.
To identify miRNA-target genes in podocytes in vivo, Ago-IP (Argonaute immunoprecipitation) combined with subsequent qPCR analysis of the miRNA regulated targets was performed using immortalized human and murine podocytes. The enrichement of the targets in the Ago-bound sample could be confirmed.
Two methods for miRNA level manipulation, “miRNA-sponges” for a knockdown of miRNA families and the genomic knockout of miRNAs using TALE nucleases were applied successfully in different cultured cell types. Sponges directed against several miRNA families highly expressed in podocytes were proven to be functional by luciferase assays in immortalized human podocytes. The genomic locus of mir-30a could be knocked out using TALE nucleases in HEK293T cells, yielding knockout cell lines. The downregulation of the mature miR-30a-5p as well as the upregulation of a known miR-30a-5p target in podocytes, Notch1 (Wu et al. 2014), could be shown in these knockout cell clones.
The transcription factor LMX1B plays an important role for the maintenance of podocyte structure and function. To investigate its possible effect on miRNA levels in vivo, glomeruli and podocytes were isolated from inducible Lmx1b knockout mice and compared to control mice. In the Lmx1b knockout podocytes, 48 mature miRNAs were found to be upregulated and 40 miRNAs were found to be downregulated compared to the control animals. This indicates a role of this transcription factor in controlling miRNA expression in podocytes. A miRNA family that was earlier found to be downregulated in glomeruli after Lmx1b knockout, the miR-200 family, was identified to be expressed in the non-podocyte glomerular cells, indicating a secondary effect of the transcription factor inactivation. The miRNAs showing altered expression levels after Lmx1b knockout are putative starting points for further analyses of the genesis of the nail-patella syndrome, a human genomic disease caused by mutations in the LMX1B gene.
The present work sheds light on the miRNA-mediated regulatory network in podocytes, which aids in the maintenance of their complex cytoarchitecture and function in renal filtration.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 23:14
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