| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (9MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-338363
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.33836
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 13 Juni 2016 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Tag der Prüfung: | 30 März 2016 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische Technologie (Prof. Göpferich) |
| Stichwörter / Keywords: | Nanopartikel, Multivalenz, Angiotensin-Rezeptor, Ligand, hinterer Augenabschnitt, Glaukom, diabetische Retinopathie, altersbedingte Makuladegeneration |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 615 Pharmazie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 33836 |
Zusammenfassung (Englisch)
The present work investigated the multivalent binding of nanoparticles towards cells and how they can be utilized for treating severe ocular diseases. It was more than 100 years ago when Paul Ehrlich coined the idea of the ‘Magic Bullet’, a personalized and tailored drug that precisely targets diseased cells in the human body and leaves healthy cells untouched. Among many examples that resemble ...
Zusammenfassung (Englisch)
The present work investigated the multivalent binding of nanoparticles towards cells and how they can be utilized for treating severe ocular diseases.
It was more than 100 years ago when Paul Ehrlich coined the idea of the ‘Magic Bullet’, a personalized and tailored drug that precisely targets diseased cells in the human body and leaves healthy cells untouched. Among many examples that resemble this concept, targeted delivery of nanoparticles to specific tissues is often designated as the most promising one. Active targeting, which is addressing nanoparticles to individual tissues, is usually achieved by conjugating ligand molecules to the colloidal surface. Moreover, since multiple ligand molecules can be attached to the particle corona, highly sophisticated multivalent material-cell interactions are imaginable. Although they add another layer of complexity to the system, they may ultimately determine a particle’s fate.
A prominent example in which nanoparticle formulations have gained much interest recently is the treatment of pathologic neovascularizations in the posterior eye segment. Their outstanding features, which include the encapsulation of drugs, the accumulation in areas of increased vascular permeability or the controlled release of active ingredients, has prompted immense research efforts for the intravitreal but also systemic application. In addition, certain nanomaterials exhibit unique anti-proliferative and anti-oxidative effects that could impressively expand and improve the current therapeutic arsenal (Chapter 1).
However, although there are tremendous efforts going into the design and development of nanoparticle formulations, the actual amount of novel formulations entering clinical trials or being approved is very limited. A potential pitfall that could reduce nanoparticle applicability is the loss of nanoparticle targeting efficacy due to ligand affinity decrease, which can be a consequence of ligand attachment to the nanoparticle polymer corona. EXP3174, a non-peptide angiotensin receptor blocker, underwent a 580-fold decreased receptor binding affinity after conjugation to a PEG chain. When multivalently presented on a nanoparticle surface, initially lost affinity was rapidly regained, which was a consequence of the nanoparticle’s capability to bind several receptors simultaneously (Chapter 3). However, for this to happen, a sufficiently high receptor density is required. Owing to the weak affinity of a monovalent nanoparticle-cell interaction compared to the multivalent interaction, the colloids gained the ability to differently target cells depending on their receptor expression levels. For this reason, EXP3174-targeted Qdots strongly associated with NCI-295R cells that showed a high AT1R expression, but not with HeLa cells with a low receptor expression. The receptor’s physiological ligand angiotensin II is a potent growth factor and of critical importance for neovascularizations in the posterior eye segment. Hence, the type-1 receptor in the ocular vasculature is a logical target for nanoparticles that are capable of blocking the receptor over an extended period of time. EXP3174-Qdots specifically accumulated in the retinal and choroidal vessels but not in off-target tissue such as the kidney, which was attributed to the multivalent ligand display. Remarkably, the nanoparticle’s blood circulation time did not suffer from ligand attachment but, in contrast, was improved (Chapter 4).
Since the semiconductor Qdots were mainly used as reporter particles in the preceding studies due to their outstanding fluorescence properties, the multivalent binding and blocking of AT1 receptors was transferred to drug-polymer-conjugates as potential therapeutic agents. EXP3174-modified multi-arm PEGs and generation 5 PAMAM dendrimers both blocked AT1R receptors with nanomolar affinity. Due to their unique microarchitecture PAMAM dendrimers retained a 6 fold higher receptor binding affinity than the branched PEGs, whose lowered affinity was presumably due to hydrophobic interactions between EXP3174 and the polymer. Both conjugates showed no measurable in vitro cytotoxicity, which was impressively in stark contrast to the unmodified PAMAM dendrimers (Chapter 5).
Compared with antagonist-modified nanoparticles which are not immediately taken up but rest at the cell membrane, agonist-modified colloids are promptly endocytosed into the cell after receptor activation. However, as tested with calcium mobilization experiments the instant cell uptake did not impede the formation of multivalent nanoparticle-cell interactions for angiotensin II-targeted Qdots, as the agonist-targeted colloids exhibited a 30-fold higher affinity than the free ligand. In a cell binding model the ligand-modified Qdots exclusively interacted with receptor expressing cells. The resulting receptor-mediated endocytosis occurred via clathrin-coated pits and was inhibitable with receptor antagonists. Interestingly, although the immediate uptake did not suppress multivalent binding formation, the multivalency was lower than observed for antagonist-modified nanoparticles (Chapter 6).
The trabecular meshwork, a sponge-like tissue in the iridocorneal angle of the eye is responsible for aqueous humor drainage and thus pivotal key player in the pathogenesis of primary open-angle glaucoma. Nanoparticles coated with cyclic RGD peptides and targeted towards integrin receptors were rapidly and massively endocytosed into human trabecular meshwork cells. The association to the cultured trabecular meshwork cells was significantly higher than the association to the prominent αvβ3 integrin-overexpressing glioblastoma cell line U87-MG. As demonstrated by real-time PCR and western blotting, the cyclic RGD peptide mitigated connective tissue growth factor-induced fibrotic events such as matrix deposition and stress fiber formation. The experimental data convincingly illustrated why cyclic RGD peptides are powerful targeting moieties when the aim is to address nanoparticles, e.g. for gene delivery, specifically to the trabecular meshwork (Chapter 7).
The present work unveiled the immense potential of multivalent nanoparticle-cell interactions and promising applications thereof. Not only can nanoparticle multivalency be utilized to differentially target organs, tissue and cells based on divergent receptor expression levels, but it can also be used to amplify cell-specific targeting. The difference in multivalent behavior between antagonistic and agonistic nanoparticles targeting the AT1 receptor was clearly evident and a result of different receptor responses upon ligand binding. In this regard, especially the binding of antagonistic nanoparticles to angiotensin receptors of retinal and choroidal blood vessels and thus blockade of these receptors holds great potential for tissue-specific attenuation of pathologic neovascularizations. In a similar fashion, blockade of integrin receptors by cyclo(RGDfC)-coated nanoparticles and cell-specific delivery of therapeutic agents to the trabecular meshwork is a promising strategy to enhance glaucoma treatment options that currently appear on the horizon.
Taken together, the newly gained understanding of nanoparticles and their multivalent interactions with cells has significant potential to carve out new paths for treating severe diseases of the anterior and posterior eye segment.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit untersucht in welchem Umfang Nanopartikeln von multivalenten Ligand-Zell-Interaktionen Gebrauch machen und welche möglichen Therapieoptionen für die Behandlung von Augenerkrankungen dadurch ermöglicht werden. Vor mehr als 100 Jahren führte Paul Ehrlich die Idee der „Magischen Kugeln“ ein. Darunter verstand er einen personalisierten und maßgeschneiderten Wirkstoff, der im Körper ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit untersucht in welchem Umfang Nanopartikeln von multivalenten Ligand-Zell-Interaktionen Gebrauch machen und welche möglichen Therapieoptionen für die Behandlung von Augenerkrankungen dadurch ermöglicht werden.
Vor mehr als 100 Jahren führte Paul Ehrlich die Idee der „Magischen Kugeln“ ein. Darunter verstand er einen personalisierten und maßgeschneiderten Wirkstoff, der im Körper ausschließlich erkrankte Gewebe und Zellen therapierte und gleichzeitig gesunde Zellen unversehrt ließ. Nanopartikel, welche zielgerichtet an eine bestimmte Zell- oder Gewebeart adressiert sind, erweisen sich als eines der prominentesten Beispiele von Paul Ehrlichs Konzept. Um dieses Targeting zu erreichen, werden Ligandenmoleküle auf der Oberfläche von kolloidalen Spezies immobilisiert. Da eine Vielzahl von Liganden auf der Korona des Nanopartikels gebunden werden können, sind hier hochkomplexe multivalente Material-Zell Interaktionen vorstellbar. Obwohl diese Interaktionen die Kompliziertheit des Systems drastisch erhöhen, können sie schlussendlich für das Schicksal der Nanopartikel im Körper verantwortlich sein.
Ein therapeutisches Gebiet in dem Nanopartikelformulierungen in den vergangen Jahren deutliches Interesse erfahren haben ist die Behandlung von pathologischen Neovaskularisierungen im hinteren Augenabschnitt. Aufgrund ihrer herausragenden Merkmale zu denen u.a. die Verkapselung von Wirkstoffen, die Anreicherung in Arealen erhöhter vaskulärer Permeabilität sowie die verzögerte und kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen zählen, wurden Nanopartikelsystem für die intravitreale wie auch für die systemische Verwendung detailiert untersucht. Zusätzlich dazu weisen verschiedene Nanopartikelspezies einzigartige anti-proliferative und anti-oxidative Effekte auf, welche in der Lage wären das derzeitige therapeutische Arsenal eindrucksvoll zu erweitern (Kapitel 1).
Obwohl jedoch enorme Anstrengungen unternommen werden um Nanopartikel zu entwickeln ist die eigentliche Nummer an neu zugelassenen Formulierungen relativ gering. Ein möglicher Grund hierfür ist der Verlust an Affinität der Liganden nachdem sie auf der Polymerkorona der Nanopartikel immobilisiert wurden. Anhand von EXP3174, einem nicht-peptidischen Angiotensin-Rezeptorblocker, konnte gezeigt werden dass die Bindung des Liganden an eine Polymerkette mit einem 580-fachen Affinitätsverlusts einhergeht. Gleichzeitig sind Nanopartikel jedoch in der Lage, da sie mehrere Rezeptoren auf der Zelloberfläche gleichzeitig binden können, diese verlorene Affinität wettzumachen (Kapitel 3). Damit dieser Prozess jedoch stattfinden kann, muss eine ausreichend hohe Rezeptordichte auf der Zelloberfläche vorhanden sein. Aufgrund der niedrigen Affinität einer monovalenten Ligand-Zell-Interaktion im Vergleich zu der multivalenten Interaktion zeigten diese Nanopartikel die Fähigkeit, ausschließlich Zellen zu binden welche eine hohe Anzahl an Rezeptoren exprimierten. Gleichzeitig erfolgte keine Bindung an Zellen mit einer niedrigen Rezeptordichte. Angiotensin II, der physiologische Ligand am Angiotensin-Rezeptor, ist ein potenter Wachstumsfaktor und von zentraler Bedeutung bei Neovaskularisierungen am hinteren Augenabschnitt. EXP3174-konjugierte Nanopartikel, welche den Angiotensin-Rezeptor Subtyp 1 (AT1R) binden, akkumulierten spezifisch in retinalen und choroidalen Blutgefäßen am hinteren Auge. Diese Blutgefäße proliferieren unkontrolliert bei diabetischer Retinopathie und Altersbedingter Makuladegeneration und sind für Blindheit und Sehverlust bei Fortschreiten der Erkrankungen verantwortlich. Interessanterweise zeigten EXP3174-konjugierte Nanopartikel keine Akkumulation anderen AT1R-exprimierenden Geweben, welches der multivalenten Bindung zugeordnet werden konnte (Kapitel 4).
Da aufgrund ihrer einzigartig starken Fluoreszenz in den vorhergegangen Studien vor allem Quantenpunkte als Nanopartikelspezies eingesetzt wurden, war das Ziel das Konzept der multivalenten Bindung und Blockade auf Polymer-Wirkstoff-Konjugate zu übertragen. Mehrarmige Polyethylenglykol-Polymere und Poly(amidoamin)-Dendrimere behielten nach Konjugation mit EXP3174 ihre nanomolare Affinität. Aufgrund der einzigartigen Dendrimer Mikroarchitektur zeigten diese eine höhere Affinität als die mehrarmigen Polyethylenglykole, deren Affinität durch hydrophobe Wirkstoff-Polymer Interaktionen vermindert wurde. Beide Konjugate zeigten keine in vitro Zelltoxizität, was im starken Kontrast zu den unkonjugierten Dendrimeren stand (Kapitel 5).
Im Vergleich zu Nanopartikeln die mit einem Rezeptorblocker konjugiert sind, lösen Nanopartikel, welche Rezeptor-Agonisten auf der Oberfläche tragen, eine sofortige Endozytose des Kolloids in das Zellinnere aus. Anhand von Angiotensin II-konjugierten Nanopartikeln konnte gezeigt werden das trotz dessen die Ausbildung multivalenter Interaktionen möglich ist. Die Aufnahme der Nanopartikel in die Zelle erfolgte mithilfe von Clathrin-vermittelter Endozytose und war hemmbar mit Rezeptorblockern. Obwohl durch die multivalente Bindung die Aufnahme nicht unterbunden wurde, so war das Ausmaß der Multivalenz im Vergleich zu den EXP3174-modifizierten Nanopartikeln bedeutend geringer (Kapitel 6).
Das Trabekelwerk ist ein schwammartiges Gewebe im Iridokornealwinkel. Es ist verantwortlich für den Abfluss von Kammerwasser aus der vorderen Augenkammer und hat daher eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese vom primären Offenwinkel-Glaukom. Nanopartikel auf deren Oberfläche ein zyklisches RGD-Peptid immobilisiert wurde, zeigten eine zügige Endozytose in kultivierte Trabekelwerkszellen durch Bindung an Integrine. Zusätzlich zeigte das RGD-Peptid einen positiven Effekt auf eine CTGF (connective tissue growth factor) induzierte Fibrose, welche mit Ablagerungen von Matrixmaterial sowie der Ausbildung von Stressfasern einherging (Kapitel 7).
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 22:37
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