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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-347387
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.34738
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 19 October 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 14 October 2016 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Label-free, DMR, RWG, SPR, ECIS |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 34738 |
Abstract (English)
Label-free cell-based assays have been attracting growing attention in drug research. In this context, optical approaches based on evanescent electric fields (e.g. resonant waveguide grating, RWG; dynamic mass redistribution, DMR) and electrochemical impedance analysis (e. g. electric cell-substrate impedance sensing, ECIS) are the most widespread techniques. The aim of this doctoral thesis was ...
Abstract (English)
Label-free cell-based assays have been attracting growing attention in drug research. In this context, optical approaches based on evanescent electric fields (e.g. resonant waveguide grating, RWG; dynamic mass redistribution, DMR) and electrochemical impedance analysis (e. g. electric cell-substrate impedance sensing, ECIS) are the most widespread techniques. The aim of this doctoral thesis was to optimize and to explore the potential of two label-free methods, DMR and ECIS, to functionally characterize ligands of prototypical aminergic and peptidergic G-protein coupled receptors (GPCRs). For this purpose, histamine H1 and neuropeptide Y (NPY) Y2 and Y4 receptors were selected as examples.
With respect to the optimization of the conditions for the investigation of the human histamine H1 receptor (H1R), native U-373 MG glioblastoma and genetically engineered HEK 293T cells, either expressing the H1R alone or in combination with the adhesion protein hMSR1 were used. Reduced cell adhesion to the surface of the sensing devices affected both, the optical and the impedance-based readout, but became much more obvious in case of the DMR-assay. The co-expression of hH1R and hMSR1 in HEK 293T cells strongly enhanced the signal compared to hH1R expression alone. As the sensitivity of the optical readout is confined to a distance of 100-200 nm from the surface, depending on the wavelength of the incident light, this observation is in accordance with tighter adhesion of the co-transfectants, inducing a shorter distance between the cell membrane and the substrate. Cell adhesion was found to have a critical impact on the results of label-free cell monitoring, in particular when techniques based on evanescent electric fields are applied.
To explore the applicability and the potential of label-free assays, a set of H1R agonists and antagonists was characterized by DMR, ECIS and the data were compared with those from various signaling pathway specific readouts (Fura-2 and aequorin calcium assays, arrestin recruitment (luciferase fragment complementation) assay, luciferase gene reporter assay), gained from genetically engineered HEK293T cells. Additionally, reference data from GTPase assays and radioligand binding were considered. Histamine and other H1R agonists (betahistine, UR-KUM530) gave different assay-related pEC50 values, however, the order of potency was retained. In the luciferase fragment complementation assay, the H1R preferred -arrestin2 over -arrestin1. The calcium and the impedimetric assay depended on Gαq coupling of the H1R, as demonstrated by complete inhibition of the histamine-induced signals in the presence of the Gαq inhibitor FR900359 (UBO-QIC). Whereas partial inhibition by FR900359 was observed in DMR and the gene reporter assay, pertussis toxin (PTX) substantially decreased the response in DMR, but increased the luciferase signal, reflecting the contribution of both, Gαq and Gi, to signalling in these assays. For antagonists, the results from DMR were essentially compatible with those from conventional readouts, whereas the impedance-based data revealed a trend towards higher pKb values. ECIS and calcium assays apparently only reflect Gαq signaling, whereas DMR and gene reporter assays appear to integrate both, Gαq and Gαi mediated signaling. Regardless of that, the results confirm the value of the label-free methods, DMR and ECIS, for the characterization of H1R ligands.
As a model for peptidergic GPCRs, CHO-Gqi5-mtAEQ cells co-expressing the human NPY Y2 (Y2R) or Y4 receptor (Y4R), the chimeric Gα protein Gqi5 and mitochondrially tagged aequorin were selected. The applicability of DMR and ECIS was explored in comparison to two calcium assays (Fura-2 and aequorin). The stimulation of the Y2R by pNPY resulted in concentration-dependent signals in ECIS and DMR. The inhibition of Gαq/11 by FR900359 caused a partial reduction of the DMR signal, whereas in the presence of the Gαi/o inhibitor PTX, the DMR signal was almost completely inhibited. In CHO cells which do not express a chimeric G-protein, pNPY gave a strong DMR signal, suggesting that endogenously expressed G-proteins are sufficient to give a cellular response. This effect was only slightly reduced by FR900359. In both calcium assays with CHO-hY2-Gqi5-mtAEQ cells, PTX only slightly reduced the signal, whereas FR900359 completely suppressed the response. Depending on the assay, stimulation of the Y2R preferentially resulted in different signalling patterns characteristic of either the Gαq/11 or the Gαi/o pathway.
The stimulation of the hY4 receptor by [K4]hPP and other agonists caused a concentration-dependent effect in the DMR assay. Most of the investigated agonists were more potent in the optical label-free assay than in the aequorin calcium assay. It may be speculated that, in addition to Ca2+ mobilization, other cellular signalling mechanisms contribute to the holistic readout. The contribution of either the Gαq/11 or the Gαi/o pathway could not be unambiguously demonstrated. The discrepancies between the effects of the applied G-protein inhibitors on the different cells in the conventional and label-free assays may be attributed to the chimeric G-protein.
In summary, both noninvasive techniques are complementary to each other, but cannot fully replace reductionist signaling pathway focused assays.
Translation of the abstract (German)
Markierungsfreie zelluläre Assays sind in den letzten Jahren immer interessanter für die Arzneimittelforschung geworden. Von diesen neuen Analysetechniken sind die optischen- und impedanzbasierten Methoden am weitesten verbreitet. Ziel der Doktorarbeit war es, die optische (DMR; dynamic mass redistribution), sowie die impendanzbasierte markierungsfreie Analysemethode (ECIS, electric cell ...
Translation of the abstract (German)
Markierungsfreie zelluläre Assays sind in den letzten Jahren immer interessanter für die Arzneimittelforschung geworden. Von diesen neuen Analysetechniken sind die optischen- und impedanzbasierten Methoden am weitesten verbreitet. Ziel der Doktorarbeit war es, die optische (DMR; dynamic mass redistribution), sowie die impendanzbasierte markierungsfreie Analysemethode (ECIS, electric cell substrate sensing) am Lehrstuhl zu etablieren und für die funktionelle Charakterisierung prototypischer aminerger und peptiderger G-protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) zu optimieren. Dazu wurden der Histamin H1 Rezeptor sowie die Neuropeptid Y (NPY) Rezeptorsubtypen Y2 und Y4 als Modellrezeptoren gewählt.
Zur Optimierung der Assaybedingungen für Messungen am humanen Histamin H1 Rezeptor (H1R) wurden sowohl native U-373 MG Glioblastomzellen als auch gentechnisch veränderte HEK 293T Zellen verwendet, die den H1R alleine oder in Kombination mit dem Adhäsionsprotein hMSR1 exprimieren. Eine schwache Adhäsion der Zellen an die Sensoroberfläche hatte bei beiden markierungsfreien Assays einen negativen Einfluss auf gemessene Signal, wobei dieser Effekt im Fall der optischen Methode stärker ausgeprägt war als beim impedimetrischen Assay. Die Signalstärke war bei HEK 293T Zellen, die sowohl den hH1R als auch hMSR1 exprimieren, wesentlich intensiver als bei den HEK 293T Zellen, die lediglich den hH1R exprimieren. Da die optische Methode zelluläre Effekte nur in einem Abstand bis zu 200 nm von der Oberfläche erfasst, ist dieses Ergebnis durch die stärkere Adhäsion der HEK 293T hMSR1 Zellen erklärbar, die vermutlich zu einer Verkürzung des Zell-Substrat-Abstands führt. Die Zelladhäsion an das Substrat erwies sich somit als kritischer Parameter, insbesondere Messungen mit optischen markierungsfreien-Methoden.
Um die Anwendbarkeit und das Potenzial markierungsfreier Assays detaillierter zu untersuchen, wurde eine Auswahl von H1R Agonisten und Antagonisten mit DMR und ECIS charakterisiert. Die erhaltenen Daten wurden mit Ergebnissen aus unterschiedlichen konventionellen Assays (Fura-2 und Aequorin Calcium Assays, Arrestin Assay sowie Luciferase Genreporter Assay) mit gentechnisch veränderten HEK293T Zellen verglichen. Zusätzlich wurden Referenzdaten aus GTPase Assays und Radioligand Bindungsstudien einbezogen. Die pEC50-Were von Histamin und anderen H1R Agonisten (Betahistin, UR-KUM530) variierten zwischen den Analysemethoden, die Rangordnung der Agonisten nach ihrer Potenz blieb aber gleich. Im Arrestin-Rekrutierungsassay zeigte der H1R eine höhere Affinität zum ß-Arrestin2 als zum ß-Arrestin1. Die im Calcium- und im impedimetrischen Assay gemessenen Effekte waren Gαq vermittelt, was vollständige Hemmung des Histamin-induzierten Signals durch den Gαq Inhibitor FR900359 (UBO-QIC) gezeigt werden konnte. Dagegen ließ sich der Histamin-Effekt im DMR und im Genreporter-Assay durch FR900359 nur partiell unterdrücken. Außerdem wurde das Histamin-induzierte Signal durch Pertussistoxin (PTX) im DMR stark gehemmt, im Luciferase Assay dagegen verstärkt. Dies spricht dafür, dass der H1R in den untersuchten Zellen sowohl an Gαq als auch an Gαi koppelt. Für H1R Antagonisten lieferten DMR und konventionelle Assays vergleichbare Ergebnisse, während die mit ECIS ermittelten pKB-Werte tendenziell höher lagen. Offenbar reflektieren Calciumassay und ECIS nur die Gαq vermittelten Signale, während DMR und Genreporterassay sowohl Gαq- als auch Gαi-gekoppelte zelluläre Effekte erfassen. Ungeachtet dessen bestätigen die Ergebnisse, dass die beiden markierungsfreien Methoden, ECIS und DMR, zur Charakterisierung von H1R Liganden verwendet werden können.
Als Model für peptiderge GPCRs wurden CHO-Gqi5-mtAEQ Zellen ausgesucht, die entweder den humanen NPY Y2 (Y2R) oder den Y4 Rezeptor (Y4R), das chimäre Gα Protein Gqi5 und Aequorin (mitochondrial lokalisiert) koexprimieren. Die Anwendbarkeit von ECIS und DMR wurde im Vergleich mit zwei Calcium-Assays (Fura-2 und Aequorin) untersucht. In beiden markierungsfreien Methoden führte die Stimulation des Y2R mit pNPY zu einem konzentrationsabhängigen Signal. Durch den Gαq/11 Inhibitior FR900359 wurde das DMR-Signal partiell reduziert, wogegen der Gαi/o-Inhibitor PTX das Signal fast vollständig hemmte. CHO-Zellen, die das chimäre G-Protein Gqi5 nicht exprimieren, zeigten ein starkes pNPY induziertes DMR-Signal, was dafür spricht, dass die konstitutiv exprimierten G-Proteine ausreichen, um einen zellulären Effekt auszulösen. Dieses Signal konnte durch FR900359 nur geringfügig gehemmt werden. In den beiden Calciumassays wurde das pNPY Signal durch FR900359 vollständig und durch PTX nur teilweise gehemmt. Abhängig vom verwendeten Assay führte die Stimulation des Y2R zu unterschiedlichen Signalmustern, die entweder für Gαq/11 oder für Gαi/o vermittelten Signalwege charakteristisch sind.
Die Stimulation mit [K4]hPP und anderen hY4 Rezeptor Agonisten ergab konzentrationsabhängige Signale im DMR-Assay. Die meisten untersuchten Agonisten waren im optischen markierungsfreien Assay potenter als im Aequorin Calciumassay. Es ist nicht auszuschließen, dass neben der Ca2+-Mobilisation weitere zelluläre Signalwege zum holistischen Readout beitragen. Der jeweilige Anteil des Gαq/11- oder Gαi/o-Proteins am Gesamtsignal konnte nicht zweifelsfrei gezeigt werden. Die Diskrepanzen zwischen den Wirkungen der verwendeten G-Protein Inhibitoren auf die verschiedenen Zellen in den konventionellen und den markierungsfreien Assays, sind wahrscheinlich auf das chimäre G-Protein in diesen artifiziellen Systemen zurückzuführen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben gezeigt, dass die beiden holistischen markierungsfreien Methoden zueinander komplementär sind, aber reduktionistische, auf bestimmte Signalwege ausgelegte Methoden nicht ersetzen können.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 22:00
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