| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (9MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-352653
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.35265
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 28 Februar 2017 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Michael Thomm |
| Tag der Prüfung: | 15 Februar 2017 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Stichwörter / Keywords: | Archaea, Transcription initiation, Pyrococcus, TFB, Bpa, DNA bending, TFB B-reader, UV Cross-linking |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 35265 |
Zusammenfassung (Englisch)
The preinitiation complex of the transcription machinery in archaeal organisms resembles a simplified version of the eukaryotic RNA polymerase II transcription system. Both systems share homologous general transcription factors to recruit RNA polymerase to the promoter to initiate RNA synthesis. The transcription factor (II)B plays an important role during transcription initiation. Based on ...
Zusammenfassung (Englisch)
The preinitiation complex of the transcription machinery in archaeal organisms resembles a simplified version of the eukaryotic RNA polymerase II transcription system. Both systems share homologous general transcription factors to recruit RNA polymerase to the promoter to initiate RNA synthesis. The transcription factor (II)B plays an important role during transcription initiation. Based on eukaryotic cryo-EM and crystal structures several functional interactions and structural transitions of TF(II)B were proposed. To detect specific interactions of the archaeal P. furiosus TFB during transcription initiation different in vitro transcription assays were performed. In addition, the replication protein A of P. furiosus was also investigated using various in vitro experiments. Crosslinking experiments using TFB, which contained a UV inducible photo crosslinker, and
site-specific radioactively labeled DNA templates revealed an almost similar topology of the archaeal TFB B-reader and B-linker domains in the preinitiation complex in comparison to corresponding regions predicted in eukaryotic structures. Unlike it was postulated in open complex models, the non-transcribed strand is located closer to the B-linker strand than the B-linker helix. The B-core amino acid F192 contact DNA 19 nucleotides upstream the transcribed strand, in accordance to a published crystal of P. woesei TATA/TBP/TFB-core structure, but is different to predicted eukaryotic closed and open complex models. Crosslinking experiments in stalled complexes showed that RNA interacts with the B-reader loop at a length of 6nt, and further clashes with the B-reader helix domain with a length of 8nt. At register +10 the TFB B-reader is displaced, which causes collapse of the transcription bubble. It was also demonstrated that TFB is present at register +6 to +14 in the complex, and tended to be released from register +15 onwards, indicating a destabilization of TFB at register +13/+14.
Alanine substitutions of amino acids of the TFB B-reader loop revealed that this region mainly stabilizes the transcription bubble due to charge-dependent interactions with the
transcribing strand. In contrast to the predicted RNA-DNA separation model derived from a eukaryotic initially transcribing complex, RNA-strand separation does not depend on the charge of the PfuTFB B-reader loop.
Single molecule FRET experiments revealed that DNA bending depends on the presence of TFB in P. furiosus.
In vitro transcription assays with RPA showed that this protein has binding preference to single stranded DNA. Experiments further showed that RPA is not involved in transcription
initiation, but it stimulates transcription. Therefore RPA functions during elongation of transcription, possibly due to a stabilization of the RNA polymerase and increase of the
processivity. The results presented here give a more detailed insight into molecular interactions of TFB and are the first biochemical data on dynamic rearrangements of TFB during transcription initiation and transition to early elongation. It further deepens the understanding of archaeal transcription processes and complements structural information derived from related eukaryotic organisms.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Präinitiationskomplex der Transkriptionsmaschinerie archaeeller Organismen gleicht einer vereinfachten Version des eukaryotischen RNS Polymerase II Komplexes. Beide Systeme verwenden zum Teil homologe Transkriptionsfaktoren, um die RNS Polymerase zur Initiierung der RNS-Synthese an den Promoter zu rekrutieren. Der Transkriptionsfaktor (II)B hat dabei mehrere wichtige Funktionen in diesem ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Präinitiationskomplex der Transkriptionsmaschinerie archaeeller Organismen gleicht einer vereinfachten Version des eukaryotischen RNS Polymerase II Komplexes. Beide
Systeme verwenden zum Teil homologe Transkriptionsfaktoren, um die RNS Polymerase zur Initiierung der RNS-Synthese an den Promoter zu rekrutieren. Der Transkriptionsfaktor (II)B hat dabei mehrere wichtige Funktionen in diesem Komplex. Basierend auf eukaryotischen
Kristall- und cryo-EM Strukturen wurden funktionelle Interaktionen und strukturelle Veränderungen vorhergesagt. Um spezifische Wechselwirkungen des archaeellen TFB aus
P. furiosus während der Transkriptionsinitiation zu detektieren, wurden verschiedene in vitro Transkriptionsexperimente verwendet. Zudem wurde ein weiteres Protein, das Replikationsprotein A aus P. furiosus, in verschiedenen Experimenten hinsichtlich dessen Funktion untersucht. Crosslink-Experimente, in denen TFB mit einem UV-induzierbaren Crosslinker ausgestattet und zusammen mit spezifisch radioaktiv markierten DNS Matrizen verwendet wurde, zeigten, dass die TFB B-reader und B-linker Domänen eine nahezu ähnliche Lage im Präinitiationskomplex aufweisen, wie die entsprechenden Domänen in eukaryotischen Strukturen. Anders als im Model eines offenen Transkriptionskomplexes liegt der nichttranskribierte
Strang näher am B-linker Strang als an der B-linker Helix. In Übereinstimmung mit einer publizierten P. woesei TATA/TBP/TFB-Kern Struktur zeigte die Aminosäure F192 aus der TFB Kerndomäne einen Kontakt zur DNS 19 Nukleotide stromaufwärts am transkribierten Strang, und weist damit Unterschiede zu modellierten Strukturen von geschlossenen und offenen eukaryotischen Transkriptionskomplexen auf. Crosslink- Experimente in gestellten Komplexen zeigten, das RNA mit einer Länge von 6nt mit der Breader Schleife interagiert, und anschließend mit einer Länge von 8nt mit der B-reader Helix zusammenstößt. An Position +10 ist die TFB B-reader Domäne verschoben, was zu einem Zusammenbruch der Transkriptionsblase führt. Es konnte auch gezeigt werden, dass TFB in den Registern +6 bis +14 im Komplex vorhanden ist, und dazu tendiert, ab Position +15 freigesetzt zu werden, was auf eine Destabilisierung des TFB an Position +13/+14 hindeutet.
Alanin-Substitutionen von Aminosäuren der TFB B-reader Schleife zeigten, dass diese Region hauptsächlich die Transkriptionsblase stabilisiert aufgrund ladungsabhängiger
Wechselwirkungen mit dem transkribierten Strang. Im Gegensatz zum postulierten RNS-DNS-Separationsmodel basierend auf einer eukaryotischen Struktur eines initial
transkribierenden Komplexes ist die Trennung der Stränge nicht von der Ladung der TFB Breader Schleife abhängig.
In Einzelmolekül-FRET Studien konnte gezeigt werden, dass die DNS-Biegung in P. furiosus von TFB abhängig ist.
In vitro Studien mit RPA zeigten, dass dieses Protein eine Einzelstrang-Präferenz besitzt. Die Experimente deuten darauf hin, dass RPA nicht an der Initiation beteiligt ist, aber
Transkription konnte stimuliert werden. Es wurde gezeigt, dass RPA in die Elongation der Transkription eingreift, da es möglicherweise die RNS Polymerase stabilisiert und dessen
Prozessivität erhöht.
Die hier gezeigten Daten geben einen detaillierteren Einblick in molekulare Interaktionen von TFB, und sind die ersten biochemischen Daten über dynamische Veränderungen von TFB während der Transkriptionsinitiation und dem Übergang in die frühe Elongation. Das Verständnis der archaeellen Transkriptionsprozesse soll damit vertieft werden, und die
strukturellen Informationen aus den verwandten eukaryotischen Organismen komplettieren.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 21:33
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