| License: Publishing license for publications excluding print on demand PDF - Accepted Version (10MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-355071
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.35507
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 April 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 17 March 2017 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | Imidazole glycerol phosphate synthase, protein-protein interaction, allostery, ancestral sequence reconstruction |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 35507 |
Abstract (German)
Imidazole glycerol phosphate synthase (ImGPS) is a bi-enzyme complex that consists of the glutaminase subunit HisH and the cyclase subunit HisF. HisH hydrolyzes glutamine to glutamate and ammonia, which is transported through a channel to the active site of HisF where it reacts with N´-[(5´-phosphoribulosyl)formimino]-5-aminoimidazole-4-carboxamide-ribonucleotide (PRFAR) to imidazole glycerol ...
Abstract (German)
Imidazole glycerol phosphate synthase (ImGPS) is a bi-enzyme complex that consists of the glutaminase subunit HisH and the cyclase subunit HisF. HisH hydrolyzes glutamine to glutamate and ammonia, which is transported through a channel to the active site of HisF where it reacts with N´-[(5´-phosphoribulosyl)formimino]-5-aminoimidazole-4-carboxamide-ribonucleotide (PRFAR) to imidazole glycerol phosphate (ImGP) and 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribotide (AICAR). ImGP and AICAR are further used in histidine and de novo purine biosynthesis, rendering ImGPS a key metabolic enzyme. The sequential HisH and HisF reactions are tightly coupled: glutaminase HisH activity is allosterically induced by the binding of PRFAR to the active site of HisF. The structural bases for complex formation between HisH and HisF and for the coupling of their catalytic activities are poorly understood. Thus, HisF:HisH is a paradigm for the study of protein-protein interactions and allosteric regulation. Moreover, only plants, fungi, bacteria, and archaea are able to synthesize histidine. Thus, the inhibiton of ImGPS might be a potential therapeutic strategy to fight pathogenic microorganisms. In this context, recently, a peptide was identified that impedes the glutaminase activity in ImGPS from Thermotoga maritima (tm). It has been hypothesized that the peptide inhibits the catalytic activity of HisF:HisH by binding to tmHisF in the complex interface, however, the exact HisF:peptide interaction sites and the mode of inhibition remained elusive.
Within the first part of this thesis, nuclear magnetic resonance (NMR) titration experiments demonstrated that the inhibitory peptide mainly interacts with structural elements and residues around positions 71-77 and 90-99 in HisF. Parts of this set of residues belong to the HisF:HisH interface and are thought to be involved in allosteric signal transduction, based on previous NMR and molecular dynamics data. This suggests that the peptide inhibits glutaminase activity by perturbing the interaction and allosteric communication between the HisF and HisH subunits.
Within the second part of this thesis, residues of HisF that are crucial for its structural and functional interaction with HisH should be identified. For this purpose, it was planned to analyze the interaction of various combinations of HisF and HisH enzymes. However, these experiments could not be performed due to the insolubility of most of the tested proteins. In order to produce proteins that can be characterized, the primordial HisF and HisH enzymes from the last universal common ancestor (LUCA) were resurrected by ancestral sequence reconstruction (ASR). LUCA-HisF and LUCA-HisH formed a high-affinity complex; however, LUCA-HisH was catalytically inactive, probably due to inaccuracies of ASR. In contrast, LUCA-HisF was catalytically active and could be used for further analysis, which was performed as follows: Initial experiments showed that HisH from Zymomonas mobilis (zmHisH) tightly binds to LUCA-HisF but not to the present-day HisF from Pyrobaculum arsenaticum (paHisF), which are separated by 103 residues. Following the characterization of a reconstructed evolutionary intermediate linking LUCA-HisF and paHisF and the inspection of the ImGPS interface, the number of candidate HisF residues crucial for binding to zmHisH could be narrowed to nine. Subsequent in silico mutagenesis based on homology modeling indicated that a single phenylalanine at position 74 in HisF was most important for binding to zmHisH. The decisive role of this “hot spot” residue for complex formation between HisF and zmHisH was confirmed by extensive experimental site-directed mutagenesis. Subsequently, primordial HisF proteins were also utilized to disentangle mechanistic principles of allosteric communication with HisH. In this context, no glutaminase activity was observed for tmHisH when bound to LUCA-HisF with PRFAR. However, the crystal structure of LUCA-HisF:tmHisH with bound glutamine revealed no significant differences compared to the catalytically active tmHisF:tmHisH complex. LUCA-HisF and tmHisF are separated by 79 residues. Although the number of potentially important residue differences could be reduced to 69 with the help of a primordial enzyme that links LUCA-HisF and tmHisF and by means of computational analysis, residues that are decisive for allostery could not be identified by this approach.
Taken together, the results of this thesis show that peptides interrupting allosteric inter-subunit communication and molecular fossils being resurrected by ASR can contribute to unraveling the structure-function relationship of multi-enzyme complexes such as ImGPS.
Translation of the abstract (German)
Die Imidazolglycerolphosphat-Synthase (ImGPS) ist ein Bienzymkomplex, der aus der Glutaminase-Untereinheit HisH und der Zyklase-Untereinheit HisF besteht. HisH hydrolisiert Glutamin zu Glutamat und Ammoniak, das durch einen intermolekularen Kanal zum aktiven Zentrum von HisF diffundiert und dort mit [(5‘Phosphoribulosyl)formimino]-5-aminoimidazol-4-carboxamid-Ribonukleotid (PRFAR) zu ...
Translation of the abstract (German)
Die Imidazolglycerolphosphat-Synthase (ImGPS) ist ein Bienzymkomplex, der aus der Glutaminase-Untereinheit HisH und der Zyklase-Untereinheit HisF besteht. HisH hydrolisiert Glutamin zu Glutamat und Ammoniak, das durch einen intermolekularen Kanal zum aktiven Zentrum von HisF diffundiert und dort mit [(5‘Phosphoribulosyl)formimino]-5-aminoimidazol-4-carboxamid-Ribonukleotid (PRFAR) zu Imidazolglycerolphosphat (ImGP) und 5‘-Aminoimidazol-4-carboxamid-Ribonucleotid reagiert. ImGP und AICAR fließen in die Histidin- und de novo Purinbiosynthese, was die ImGPS zu einem Schlüsselenzym des Metabolismus macht. Die Reaktionen, die von HisH und HisF katalysiert werden, sind eng aneinander gekoppelt: Die Glutaminaseaktivität von HisH wird durch die Bindung von PRFAR an das aktive Zentrum von HisF allosterisch induziert. Die strukturellen Grundlagen der HisF:HisH Interaktion und der Kopplung ihrer enzymatischen Aktivitäten ist bisher noch weitestgehend ungeklärt. Deshalb stellt der HisF:HisH Komplex ein Musterbeispiel zur Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen und allosterischer Regulation dar. Außerdem sind nur Pflanzen, Pilze, Bakterien und Archaeen in der Lage Histidin herzustellen. Deshalb stellt die Inhibition der ImGPS eine potentielle Strategie zur Bekämpfung pathogener Mikroorganismen dar. In diesem Zusammmenhang wurde vor Kurzem ein Peptid identifiziert, das die Glutaminaseaktivität der ImGPS von Thermotoga maritima (tm) hemmt. Es wurde angenommen, dass das Peptid die katalytische Aktivität inhibiert, indem es in der Kontaktfläche der tmImGPS an die HisF Untereinheit bindet, jedoch blieb unklar wo genau das Peptid an HisF bindet und wodurch die Inhibition speziell zustande kommt.
Im ersten Teil dieser Arbeit, konnte mit Hilfe von Kernspinresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance, NMR) gezeigt werden, dass das inhibitorische Peptid vor allem mit Strukturelementen und Aminosäuren im Bereich der Positionen 71-77 und 90-99 in der HisF-Untereinheit interagiert. Einige dieser Reste befinden sich in der HisF:HisH-Interaktionsfläche und aufgrund vorheriger Studien, die auf NMR und Moleküldynamik beruhen, wird angenommen, dass diese an der Weiterleitung des allosterischen Signals beteiligt sind. Dies legt nahe, dass das Peptid die Glutaminaseaktivität hemmt, indem es die Interaktion und allosterische Kommunikation zwischen HisF und HisH stört.
Im zweiten Teil der Arbeit sollten Reste von HisF, die sowohl für die strukturelle als auch für die funktionelle Interaktion von Bedeutung sind, identifiziert werden. Zu diesem Zweck sollte die Interaktion verschiedenster Kombinationen von HisF- und HisH-Enzymen untersucht werden. Da jedoch die meisten der ausgewählten Proteine nicht löslich exprimierbar waren, konnten diese Experimente nicht durchgeführt werden. Um Proteine herzustellen, die charakterisiert werden können, wurden HisF und HisH aus dem letzten gemeinsamen Vorläufer der zellulären Organismen (last universal common ancestor, LUCA), mittels Sequenzrekonstruktion „auferweckt“. LUCA-HisF und LUCA-HisH bildeten zwar einen hoch affinen Komplex aus, jedoch war LUCA-HisH katalytisch inaktiv, was möglicherweise auf Ungenauigkeiten bei der Sequenzrekonstruktion zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu war LUCA-HisF katalytisch aktiv und konnte für weitere Analysen herangezogen werden. Diese erfolgten folgendermaßen: Erste Untersuchungen zeigten, dass die HisH-Untereinheit aus Zymomonas mobilis (zmHisH) stark an LUCA-HisF, jedoch nicht an das rezente HisF aus Pyrobaculum arsenaticum (paHisF) bindet. Beide HisF-Proteine unterscheiden sich an 103 Positionen. Die Reste in HisF, die für das unterschiedliche Bindeverhalten an zmHisH verantwortlich sind, konnten mit Hilfe der Charakterisierung eines HisF-Vorläuferproteins, das auf dem phylogenetischen Pfad zwischen LUCA-HisF und paHisF liegt, und mit Hilfe der Analyse der ImGPS Kontaktfläche, auf neun Aminosäuren eingeschränkt werden. In anschließenden in silico Mutagenesestudien, basierend auf Homologiemodellen, zeigte sich, dass vor allem ein einzelnes Phenylalanin an Position 74 in HisF entscheidend für die Bindung an zmHisH ist. Die herausragende Bedeutung dieses „hot spots“ für die Komplexbildung von HisF und zmHisH wurde in einer umfassenden gerichteten Mutagenese experimentell bestätigt. Rekonstruierte HisF-Proteine wurden anschließend ebenfalls verwendet um den Mechanismus der allosterischen Kommunikation mit HisH näher zu beleuchten. In diesem Zusammenhang konnte in Aktivitätsmessungen keine Glutaminaseaktivität für tmHisH, das mit LUCA-HisF mit gebundenem PRFAR interagiert, beobachtet werden. Die Kristallstruktur des LUCA-HisF:tmHisH Komplexes mit gebundenem Glutamin wies jedoch keine signifikanten Unterschiede zum katalytisch aktiven tmHisF:tmHisH Komplex auf. LUCA-HisF und tmHisF unterscheiden sich an 79 Positionen. Obwohl mit der Hilfe eines rekonstruierten HisF-Vorläuferenzyms, das auf dem phylogenetischen Pfad zwischen LUCA-HisF und tmHisF liegt und bioinformatischer Analyse die potentiell bedeutenden Unterschiede auf 69 Reste reduziert werden konnten, konnten keine Reste identifiziert werden, die eine wichtige Rolle für die Allosterie spielen.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass Peptide, die die Kommunikation zwischen Komplexuntereinheiten stören, sowie molekulare Fossilien, die durch Sequenzrekonstruktion „zum Leben erweckt“ wurden hilfreich sein können bei der Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen von Multienzymkomplexen wie der ImGPS.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:27
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