The translocator protein (18 kDa) (TSPO) is a highly conserved, ubiquitous protein with a high affinity in binding cholesterol. Located in the outer mitochondrial membrane (OMM), TSPO has been discussed as the key protein for the cholesterol transport and therefore as a critical factor in steroidogenesis for a long time. Since recent in vivo and in vitro studies using TSPO knock-out models have ...
Zusammenfassung (Englisch)
The translocator protein (18 kDa) (TSPO) is a highly conserved, ubiquitous protein with a high affinity in binding cholesterol. Located in the outer mitochondrial membrane (OMM), TSPO has been discussed as the key protein for the cholesterol transport and therefore as a critical factor in steroidogenesis for a long time. Since recent in vivo and in vitro studies using TSPO knock-out models have been refuting its role in steroidogenesis, it is still an open question if TSPO is involved in neurosteroidogenesis. Furthermore, studies of the last two years started to characterize TSPO as a key protein in mitochondrial metabolism, assuming that TSPO has a regulatory function in calcium (Ca2+) homoeostasis, glucose homoeostasis, mitochondrial respiration and ROS (reactive oxygen species) production. In this thesis the link between TSPO and the regulation of mitochondrial metabolism and neurosteroid synthesis was analyzed to characterize a possible role of TSPO.
In order to ascertain a possible involvement of TSPO in neurosteroidogenesis, a TSPO knock-down in mouse brain cells was performed to measure pregnenolone concentration as a precursor of neurosteroid synthesis by means of ELISA technique (enzyme-linked immunosorbent assay) and GC/MS (gaschromatography/mass spectroscopy). I was able to show that TSPO regulates neurosteroid synthesis of brain microglia cells.
The regulatory function of TSPO in mitochondrial Ca2+ homoeostasis was analyzed by means of Ca2+ imaging via FURA-2 dye. The results showed no significant differences in Ca2+ homoeostasis of TSPO knock-down and scramble cells. Using drug treatment, both TSPO agonists XBD173 and PK11195 showed TSPO unrelated effects. Only LPS and Ro5-4864 treatment lead to the assumption that the presence of TSPO might be necessary to protect the cell from cell death under special conditions.
Considering TSPO as a regulatory protein of the mitochondrial energy metabolism, the mitochondrial membrane potential was analyzed under different conditions using the ratiometric JC-1 dye. My results show a direct link between the TSPO knock-down and the significantly reduced energy state of the cell.
To further characterize TSPO as a regulator of the mitochondrial energy metabolism, the respiration was analyzed by means of High Resolution Respirometry via Oxygraph O2k. As a result I found a direct link between TSPO knock-down and an increased maximal respiration indicating the high energy demand of the cell.
This thesis describes the controversial role of TSPO in steroidogenesis according to new findings and characterizes the function of TSPO as a regulatory protein in neurosteroidogenesis. Moreover, this thesis presents new insights for TSPO as a regulatory protein in the mitochondrial metabolism.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Translokatorprotein (18 kDa) (TSPO) ist ein hochkonserviertes, ubiquitäres Protein mit einer hohen Bindungsaffinität gegenüber Cholesterol. TSPO, was in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert ist, wurde lange Zeit als Schlüsselprotein für den Cholesterintransport und somit als kritischer Faktor für die Steroidsynthese diskutiert. Doch die jüngsten in vivo- und in vitro-Studien, die vor ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Translokatorprotein (18 kDa) (TSPO) ist ein hochkonserviertes, ubiquitäres Protein mit einer hohen Bindungsaffinität gegenüber Cholesterol. TSPO, was in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert ist, wurde lange Zeit als Schlüsselprotein für den Cholesterintransport und somit als kritischer Faktor für die Steroidsynthese diskutiert. Doch die jüngsten in vivo- und in vitro-Studien, die vor allem auf genetischen TSPO Knock-out Modellen basieren, widerlegen sehr eindeutig diese Rolle von TSPO als Schlüsselprotein in der Steroidsynthese. Dennoch ist es gegenwärtig nicht geklärt, ob TSPO an der Neurosteroidsynthese beteiligt sein könnte. Darüber hinaus begannen Forscher in den letzten zwei Jahren, TSPO als ein Schlüsselprotein auf einem neuen Gebiet, dem mitochondrialen Stoffwechsel, zu charakterisieren. Dabei wurde untersucht, ob TSPO eine regulatorische Funktion im mitochondrialen Stoffwechsel übernimmt. Darunter zählen unter anderem die Kalzium-Homöostase, der Blutzuckerstoffwechsel, die mitochondriale Atmung und die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies.
In dieser Arbeit wurde die Verbindung zwischen TSPO und der Regulation des mitochondrialen Metabolismus sowie der Neurosteroidsynthese analysiert, um die Rolle von TSPO in diesem Gebiet zu charakterisieren.
Um eine mögliche Beteiligung von TSPO an der Neurosteroidsynthese zu ermitteln, wurde ein TSPO-Knock-down in BV-2 Mikrogliazellen durchgeführt, um die Konzentration von Pregnenolon (Ausgangsstoff für die Neurosteroidsynthese) mittels ELISA-Technik (enzymgebundenes, antikörperbasierte Nachweisverfahren) und GC / MS (Gaschromatographie / Massenspektroskopie) zu bestimmen. Ich konnte zeigen, dass TSPO die Neurosteroidsynthese von BV-2 Mikrogliazellen reguliert.
Um die regulatorische Funktion von TSPO in der mitochondrialen Kalzium-Homöostase zu untersuchen, wurde der Kalzium Haushalt von BV-2 Scramble Zellen und BV-2-TSPO-Knock-down Zellen mittels eines Bildgebungs-Experimentes (Calcium Imaging via FURA-2-Farbstoff) analysiert. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede im Kalzium-Stoffwechsel von BV-2-TSPO-Knock-Down und BV-2 Scramble Zellen. Nach einer medikamentösen Behandlung mit ausgewählten Substanzen zeigten XBD173 und PK11195 (TSPO-Agonisten) lediglich TSPO-unabhängige Effekte. Nur die Ergebnisse der LPS- und Ro5-4864- Behandlung führen zu der Annahme, dass die Anwesenheit von TSPO erforderlich ist, um die Zelle unter besonderen Bedingungen vor dem Zelltod zu schützen.
Weiterhin wurde TSPO als regulatorisches Protein des mitochondrialen Energiestoffwechsels betrachtet. Dafür wurde das mitochondriale Membranpotential unter verschiedenen Bedingungen unter Verwendung des ratiometrischen JC-1-Farbstoffs untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass ein TSPO-Knock-down mit einem reduzierten Energiezustand der Zelle (somit erhöhter Energiebedarf) einhergeht.
Zur weiteren Charakterisierung des regulatorischen Einflusses von TSPO auf den mitochondrialen Energiestoffwechsel, wurde die mitochondriale Atmung mittels zwei verschiedenen Methoden, des hochauflösenden Respirometers Oxygraph O2k und des Seahorse Flux Analyzers analysiert. Als Ergebnis war eine direkte Verbindung zwischen dem TSPO-Knock-down und einer erhöhten maximalen Respiration zu erkennen, die wiederum mit dem hohen Energiebedarf der Zelle einhergeht.
Diese Dissertationsarbeit untersucht und charakterisiert die Funktion von TSPO als regulatorisches Protein in der Neurosteroidsynthese und die darüber hinaus erlangten, neuen Erkenntnisse über TSPO als regulatorisches Protein im mitochondrialen Stoffwechsel.
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