| License: Publishing license for publications excluding print on demand (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-380844
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.38084
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Date: | 1 July 2020 | ||||||
| Referee: | Prof. Dr. Günther Bernhardt | ||||||
| Date of exam: | 29 April 2019 | ||||||
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) | ||||||
| Projects: | Internationales Doktorandenkolleg: "Receptor Dynamics: Emerging Paradigms for Novel Drugs", Elitenetzwerk Bayern, GRK 1910, Graduiertenkolleg "Medicinal Chemistry of Selective GPCR Ligands" | ||||||
| Identification Number: |
| ||||||
| Keywords: | GPCR, Biased signalling, Split luciferase complementation, Multiparametric assay, Kinetic measurements, Ligand characterisation | ||||||
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 615 Pharmacy | ||||||
| Status: | Published | ||||||
| Refereed: | Yes, this version has been refereed | ||||||
| Created at the University of Regensburg: | Yes | ||||||
| Item ID: | 38084 |
Abstract (English)
In G protein-coupled receptor (GPCR) research, there is an increasing interest in the development of biased agonists as pharmacological tools and ultimately also as drugs, since adverse effects of certain pharmaceuticals are supposed to be associated with the activation of unfavourable signalling pathways. Additionally, for several receptors, bias of endogenous agonists has been discovered. ...
Abstract (English)
In G protein-coupled receptor (GPCR) research, there is an increasing interest in the development of biased agonists as pharmacological tools and ultimately also as drugs, since adverse effects of certain pharmaceuticals are supposed to be associated with the activation of unfavourable signalling pathways. Additionally, for several receptors, bias of endogenous agonists has been discovered. Currently, the most common approach to determine biased agonism implies the application of two separate assays for detecting G protein-dependent and β-arrestin dependent signalling, respectively. Apart from the additional time needed to perform two assays instead of one, major shortcomings are associated with this approach. On one hand, the receptor sources in the employed assays can substantially differ in the extent of receptor and effector expression. On the other hand, the influence of signal amplification on the readouts of the two assays can vary tremendously. Taken together, this can lead to misinterpretations with respect to the signalling profile of the analysed agonist.
Therefore, the aim of this thesis was the development of two techniques, applicable to live cells with high throughput. Firstly, for the proximal determination of Gαq protein activation and secondly, for assessing β-arrestin recruitment. The two probes were designed to be potentially compatible with a multiparametric assay format, affording information on both signalling pathways at the same time. Both probes were engineered at a similar, proximal level within each signalling cascade, to receive information unaltered by signal amplification. Methodologically, this was achieved by split luciferase complementation (SLC) using two luciferases emitting light spectra with substantially different emission maxima.
The first assay was developed by applying SLC, using a red light-emitting luciferase, to probe the interaction of Gαq with phospholipase C-β3 (PLC-β3) proteins. By being independent on genetical receptor modifications and with its excellent Z’ value of 0.7, the sensor was proven to be very suitable for ligand characterization, which was shown for five different GPCRs. Furthermore, the sensor proved to be useful for imaging, as shown by live cell bioluminescence microscopy. Beyond these applications, the sensor might become a valuable tool for de-orphanisation and subsequent determination of signalling pathways of orphan GPCRs, the analysis of Gαq activation in cells endogenously expressing Gαq protein-coupled receptors and imaging in laboratory animals.
Attempts to translate this assay principle to Gαs and Gαi proteins, interacting with adenylyl cyclases (AC), in a reproducible manner, failed. The most probable reason for this is poor membrane trafficking of the modified ACs, which could be improved by using artificial signalling sequences or generating a synthetic and soluble AC surrogate.
For measuring β-arrestin2 recruitment, a blue light-emitting luciferase was used. During assay development it became apparent that solely focusing on signal-to-background (S/B) ratios in the initial phase, as often practiced, can be inappropriate. In fact, the development must also take the functional behaviour of the proteins into account, because otherwise, the resulting assays do not reflect the physiological behaviour of the analysed proteins anymore. For this reason, two different approaches to measure β-arrestin2 recruitment by SLC were compared: on one hand with respect to their impact on the recruitment process and, on the other hand, with respect to their influence on second messenger formation. Despite lower S/B ratios, the assay based on GPCR-NLucC/NLucN-β-arrestin2 was proven to be useful for determining ligand potencies and efficacies, and it was sensitive enough to identify iperoxo as a putative superagonist at the muscarinic acetylcholine receptors hM₁R and hM₅R with respect to β-arrestin2 recruitment. It was further demonstrated that temporal analyses of the receptor/β-arrestin2 interaction can be performed to e.g. discriminate between receptors that only transiently interact with arrestins after activation, presumably because they recycle to the plasma membrane very fast (class A), and those that show sustained interaction (class B). Furthermore, this assay principle should be broadly applicable to other GPCRs.
Finally, both probes were expressed in combination in a single HEK293T cell population. This approach was applied successfully to the hM₁R, the hM₅R and to the neurotensin receptor hNTS₁R, and to a lesser extent also to the histamine receptor hH₁R, allowing the construction of concentration-response-curves of agonists and the determination of antagonistic activities for both, Gαq activation and β-arrestin2 recruitment at the same time. Results from the former three receptors suggest that both sensors do not interfere with each other when co-expressed. However, the results obtained at the hH₁R implicate that the expression levels of the sensors need to be optimised, ideally by restricting them to the endogenous expression level of their native counterparts.
Translation of the abstract (German)
Die Forschung an G proteingekoppelten Rezeptoren (GPCRs) wird derzeit durch ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung von Rezeptoragonisten mit unausgeglichenem Signalprofil (biased agonists) geprägt. Einerseits als pharmakologische Werkzeuge, aber letztendlich auch als Medikamente, da die unerwünschten Wirkungen mancher Arzneimittel der Aktivierung unvorteilhafter Signalwege zugeschrieben ...
Translation of the abstract (German)
Die Forschung an G proteingekoppelten Rezeptoren (GPCRs) wird derzeit durch ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung von Rezeptoragonisten mit unausgeglichenem Signalprofil (biased agonists) geprägt. Einerseits als pharmakologische Werkzeuge, aber letztendlich auch als Medikamente, da die unerwünschten Wirkungen mancher Arzneimittel der Aktivierung unvorteilhafter Signalwege zugeschrieben werden. Darüber hinaus wurde für einige GPCRs biased signalling auch bei endogenen Agonisten beschrieben. Derzeit fußt die Detektion von biased agonism auf der Anwendung zweier verschiedener Messmethoden. Eine zur Bestimmung der G Proteinaktivierung und eine Zweite zur Detektion der β-Arrestinrekrutierung. Neben dem zusätzlichen zeitlichen Aufwand, der mit der Anwendung von zwei unabhängigen Detektionsmethoden einhergeht, gibt es weitere Nachteile eines solchen Vorgehens. Einerseits variieren die eingesetzten Rezeptorquellen in den verschiedenen Methoden in Bezug auf die Menge an exprimierten Rezeptoren und Effektoren. Andererseits kann sich der Einfluss der Signalamplifikation auf das gemessene Signal äußerst stark unterschieden. Zusammengenommen kann dies zu einer empfindlichen Fehlinterpretation des Signalprofils eines analysierten Agonisten führen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung zweier Messmethoden zur proximalen Detektion der Gαq Aktivierung und der β-Arrestinrekrutierung, die in lebenden Zellen mit einem hohen Durchsatz angewandt werden können. Die beiden Sensoren wurden so entwickelt, dass sie kompatibel mit einem multiparametrischen Messaufbau sind, der Informationen über beide Signalwege zur selben Zeit liefert. Die Signale selbst stammen von ähnlich proximalen Punkten in den jeweiligen Signalkaskaden. Methodisch wurde dies durch die Anwendung der Split-Luziferasekomplementation (SLC) mit zwei Luziferasen, deren Emissionsmaxima sich substanziell unterscheiden, realisiert.
Die Interaktion zwischen Gαq und Phospholipase C-β3 (PLC-β3) Proteinen wurde mit Hilfe einer rot emittierenden Luziferase detektiert. Diese Methode ist unabhängig von genetischen Modifikationen des Rezeptors und weist einen exzellenten Z‘ Wert von 0,7 auf. Die Anwendbarkeit zur Charakterisierung von GPCR Liganden konnte für fünf verschiedene Rezeptoren demonstriert werden. Des Weiteren konnte anhand von Biolumineszenzmikroskopie gezeigt werden, dass der Sensor auch für die Bildgebung genutzt werden kann. Über diese Anwendungen hinaus könnte der entwickelte Sensor zur Deorphanisierung von orphan GPCRs, in der Analyse von Zellen die Gαq-gekoppelte Rezeptoren endogen exprimieren, oder in der Bildgebung in Labortieren, nützlich werden.
Versuche, dieses Messprinzip in reproduzierbarer Weise auch auf Gαs und Gαi Proteine, die mit Adenylylcyclasen (AC) interagieren, zu übertragen, sind fehlgeschlagen. Als wahrscheinlichster Grund hierfür kann eine mangelhafte Membrantranslokation der modifizierten ACs gelten. Der Einsatz von künstlichen Signalsequenzen oder synthetische und lösliche Surrogate von ACs könnte hier zu einer Verbesserung führen.
Zur Detektion der β-Arrestin2-Rekrutierung wurde eine blau emittierende Luziferase genutzt. Hierbei zeigte sich, dass eine zu starke Fokussierung auf das Signal-/Hintergrundverhältnis (S/B Verhältnis), wie es in der Frühphase der Methodenentwicklung oft praktiziert wird, nicht ideal ist. Stattdessen muss auch die Funktion der beiden Proteine mit einbezogen werden, da andernfalls die Ergebnisse der resultierenden Methoden nicht das native Verhalten der untersuchten Proteine widerspiegeln. Aus diesem Grund wurden zwei verschiedene Herangehensweisen zur Bestimmung der Rekrutierung von β Arrestin2 mittels SLC verglichen. Einerseits in Bezug auf den Rekrutierungsprozess von β Arrestin2 selbst, andererseits in Bezug auf deren Einfluss auf die Bildung von sogenannten second messengers. Die Methode, basierend auf GPCR-NLucC/NLucN-β-Arrestin2, zeigte sich, trotz ihres schlechteren S/B Verhältnisses, als nützlich und am repräsentativsten in Bezug auf die Charakterisierung von GPCR-Liganden hinsichtlich ihres Wirkprofils. Diese Methode überzeugte außerdem mit ihrer Sensitivität, da Iperoxo als möglicher Superagonist an den muskarinischen Acetylcholinrezeptoren hM₁R und hM₅R identifiziert werden konnte. Es zeigte sich auch, dass zeitlich aufgelöste Messungen der GPCR/β-Arrestin2 Interaktion möglich sind. Damit ließ sich zwischen Rezeptoren unterscheiden, die nur transient mit β-Arrestin2 interagieren – wahrscheinlich da sie schnell wieder zu Membran „recyclen“ (Klasse A) – und solchen, die eine anhaltende Interaktion mit β-Arrestin2 zeigen (Klasse B). Grundsätzlich sollte auch dieses Messprinzip auch auf andere GPCRs übertragbar sein.
Schließlich wurden beide Sensoren zusammen in einer einzigen HEK293T Zellpopulation exprimiert. Für die Rezeptoren hM₁R, hM₅R, den Neurotensinrezeptor hNTS₁R und, in geringerem Ausmaß, für den hH₁R wurde dieses Konzept erfolgreich umgesetzt. Es konnten Konzentrations-/Wirkungskurven von Agonisten simultan für die Gαq Aktivierung und die Rekrutierung von β-Arrestin2 erhalten werden, aber auch die Bestimmung von Antagonistaktivitäten war möglich. Die Ergebnisse für die Rezeptoren hM₁R, hM₅R, hNTS₁R legen nahe, dass sich beide Sensoren unter Koexpression nicht negativ beeinflussen. Für den hH₁R zeigte sich, dass eine Optimierung der Expressionsniveaus der Sensoren nötig ist. Im Idealfall sollten diese auf das endogene Niveau der nativen Pendants der markierten Proteine begrenzt werden.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 18:54
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